Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Sommario

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di Plasmodium yoelii Ed è applicabile ad altri parassiti della malaria roditori.

Abstract

Variazione di risposta ai farmaci antimalarici e della patogenicità dei parassiti della malaria è di importanza biologica e medica. Mappatura collegamento ha portato alla identificazione di successo di geni o loci sottostante vari tratti di parassiti della malaria di roditori ^1-3 e gli esseri umani ^4-6. Il parassita della malaria Plasmodium yoelii è una delle specie di malaria molti isolato da roditori selvatici africani ed è stato adattato a crescere in laboratorio. Questa specie riproduce molte delle caratteristiche biologiche dei parassiti della malaria umana; marcatori genetici come microsatelliti e amplificato frammento lunghezza polimorfismo (AFLP) i marcatori sono stati sviluppati anche per il parassita ^7-9. Così, gli studi genetici in parassiti della malaria roditori possono essere eseguite per completare le ricerche sul Plasmodium falciparum. Qui, noi dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio in P. yoelii che sono stati pionieri di Drs. David Walliker, Richard Carter, ei suoi colleghi presso l'Università di Edimburgo ^10.

Incroci genetici in P. yoelii e altri parassiti della malaria roditori sono condotte da infettando i topi Mus musculus con un inoculo contenente gametociti di due cloni geneticamente distinte che si differenziano per fenotipi di interesse e permettendo zanzare di nutrirsi di topi infettati 4 giorni dopo l'infezione. La presenza di gametociti maschili e femminili nel sangue mouse è microscopicamente confermato prima della somministrazione. Entro 48 ore dopo il pasto, nel midgut della zanzara, i gametociti aploide differenziarsi in gameti maschili e femminili, fertilizzare, e forma uno zigote diploide (Fig. 1). Durante lo sviluppo di uno zigote in un ookinete, meiosi sembra verificarsi ^11. Se lo zigote è il risultato di fertilizzazione incrociata tra gameti di due parassiti geneticamente distinte, scambi genetici (riassortimento cromosomiche e cross-over tra i non-sorella cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi;. Fig. 2) possono verificarsi, con conseguente ricombinazione di materiale genetico di loci omologhi. Ogni zigote subisce due successive divisioni nucleari, portando a quattro nuclei aploidi. Un ookinete sviluppa in un oocisti. Una volta che il oocisti matura, migliaia di sporozoiti (la progenie della croce) sono prodotti ed emessi in hemoceal zanzara. Sporozoiti vengono raccolte dalle ghiandole salivari e iniettato in un nuovo ospite murino, dove lo sviluppo fase pre-eritrocitaria e eritrocitaria avviene. Forme eritrocitaria sono clonati e classificati in relazione ai caratteri distintivi delle linee parentali prima mappatura linkage genetico. Infezioni controllo dei singoli cloni dei genitori vengono eseguite nello stesso modo come la produzione di un incrocio.

Protocollo

Tecniche asettiche devono essere applicati a tutti i materiali che saranno somministrati in animali al fine di evitare l'introduzione accidentale di agenti infettivi esogeni in topi che possono confondere i risultati sperimentali.

1. L'infezione di topi da laboratorio con sangue stadio parassiti della malaria

1. A temperatura ambiente, disgelo due fiale contenenti il ​​sangue congelato parassiti della malaria stadio da attraversare. In questo esempio, due ceppi di roditori parassita della malaria da Plasmodium utilizzati sono yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii.
2. Montare una siringa co....

Discussione

Dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio nella malaria da Plasmodium yoelii roditore, che è applicabile anche alla produzione di croci genetica in malarie altri roditori. Infezioni di topi con singoli cloni dei genitori sono di solito eseguite per determinare la trasmissione di successo dei parassiti dei genitori per garantire che i genitori sono competenti nel produrre gameti funzionali prima di eseguire una croce.

Trasmissione di successo attraverso una zanzara è i.......

Materiali

SUPPLEMENTARI MATERIALI:

• Mantenimento di topi di laboratorio
• Manutenzione di laboratorio zanzare
• L'esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa
• Misura della densità dei globuli rossi

Mantenimento di topi di laboratorio

Femmine di ceppo inbred topo di laboratorio BALB / c, dai 5 agli 8 settimane di età, sono utilizzati nello studio. I topi sono alloggiati in uno standard a fondo compatto gabbia in policarbonato con filo-bar coperchio, dotato di alimentatore e una bottiglia d'acqua. I topi sono mantenute ad una temperatura costante (25 ± 1 ° C) ore 12:12 luce: ciclo scuro. I topi sono autorizzati a nutrirsi 2018S Harlan Teklad globale del 19% di proteine ​​dieta dei roditori estruso (sterilizzabile; da Harlan-Teklad) e dotate di bere ad libitum acidificato acqua. Gli esperimenti sugli animali sono eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso l'Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive sotto protocollo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Manutenzione di laboratorio zanzare

Le zanzare sono da un laboratorio di razza colonia di Anopheles stephensi. Gli adulti sono mantenuti in gabbie di nylon tenuti in una temperatura e umidità controllate camera (23 a 25 ° C per Plasmodium yoelii e Plasmodium chabaudi, e 19 a 21 ° C per Plasmodium berghei; 80-95% di umidità; sul 12:12 ore di luce: ciclo scuro). Zanzare adulte sono alimentati con il 10% di glucosio e 2,00% para-aminobenzoico (PABA) soluzione di acqua integrato. Per ottenere alta qualità adulti, 500 larve si sviluppano in una condizione di bassa densità in 1 L di acqua distillata in un 1.000 cm ³ piatto aperto fornito con circa 1 mg di bicarbonato di sodio. Dopo la schiusa, le larve sono dati TetraMin polvere (PETCO) fino a quando si sviluppano in fase di pupa e sono trasferiti al gabbie zanzara adulta per emergenti.

L'esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa

Con forbici pulite tagliare la punta (1,0 mm) della coda del topo infetto. Porre una goccia (0.5-1.0 mL) di sangue coda su un vetrino pulito. Topo sangue si fermerà in 1-2 min. Posizionare un vetrino pulito diffusore sulla parte superiore della goccia di sangue, mantenendola ad un angolo di 45 ° rispetto alla diapositiva campione, e permettere al sangue di assorbire per tutta la larghezza del diffusore. Tenere il vetrino e spingere in avanti il ​​vetrino diffusore rapidamente e senza intoppi per la produzione di uno striscio sottile. Lasciare che il film di sangue secco, e poi immergere i vetrini in metanolo assoluto. Lasciare che il vetrino asciugare ancora una volta prima di coprire con Giemsa (10% Giemsa colorante in acqua distillata). Dopo l'incubazione del film fluidificare il sangue per 10-15 minuti a temperatura ambiente, risciacquare con cura i vetrini con acqua di rubinetto e lasciare asciugare all'aria. Esaminare il numero di globuli rossi infetti (iRBC; vedi Figura 3 per la morfologia di RBC infetti) sotto un microscopio ottico con olio di immersione con ingrandimento 1000x (con lente obiettivo 100x) e calcolare parassitemia (il numero di iRBC per 100 RBC contati). Diversi ceppi di parassiti della malaria variare del tasso di crescita e la patogenicità. Monitoraggio della fase parasitaemias sangue può essere eseguita 24 ore dopo le iniezioni, a seconda della dose dei parassiti della malaria nel sangue stadio. Per esempio, i topi saranno microscopicamente positivo 24 ore quando iniettato con 10 ⁷ globuli rossi infetti intraperitoneale o 10 ⁶ RBC infetti per via endovenosa.

Misura della densità dei globuli rossi

Come i livelli di parasitaemias, globuli rossi (RBC) densità in topi infettati varia nel corso dell'infezione. Densità RBC deve essere misurato entro 1-2 ore prima dell'inizio della singola infezione e mixed-clone e gli esperimenti di clonazione. Ci sono due metodi di misura della densità di RBC: un conteggio manuale utilizzando Neubauer emocitometro e un conteggio automatico utilizzando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). In entrambi i metodi, prelevare 1 ml di sangue del mouse coda utilizzando un capillare di vetro (VWR) e diluire in 10 ml di PBS e mescolare bene. Per utilizzare un emocitometro Neubauer, carico 20 l di sospensione sul emocitometro. Posizionare il emocitometro su un microscopio ottico, con lenti dell'obiettivo 10x. Il emocitometro contiene una griglia suddivisa in 9 grandi piazze, e 4 grandi piazze in un angolo sono ulteriormente suddivisi in 16 piccoli quadrati. Contare il numero totale di cellule in ciascuna delle 16 piccole piazze nelle quattro piazze d'angolo. Per evitare il pregiudizio o il conteggio delle cellule che si sovrappongono una linea della griglia, conta una cella come "in" se si sovrappone le linee superiore o destro e "out" se si sovrappone le linee di basso o sinistra. Stimare il numero di celle per una piazza piccola e dividere per 0,00625 (il volume di una piccola piazza è 6,25 nL). Questo restituisce il numero di cellule per microlitro (&mu, L). Da questi dati, calcolare la densità finale delle cellule rosse del sangue moltiplicando con 10.000 (un fattore di diluizione). Sciacquare il vetrino e la camera di conteggio con acqua distillata e 70% di etanolo, aria secca. In alternativa, caricare 20 l di sospensione su un vetrino da camera Cellometer conteggio. Inserire il vetrino in una camera scivolo Cellometer (il lettore). Avviare il software Cellometer, selezionare l'opzione "globuli rossi" opzione e immettere un fattore di diluizione di 10.000. Registrare la densità di RBC.