Quantificazione delle amiloidi indotte da infezioni batteriche utilizzando la fluorescenza della tioflavina T

Abstract

Fonte: Balczon, R., et al. Metodi per rilevare gli amiloidi citotossici a seguito di infezione delle cellule endoteliali polmonari da parte di Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il protocollo per quantificare gli amiloidi nei surnatanti di coltura da cellule endoteliali polmonari infettate da batteri virulenti, utilizzando la tioflavina T, un colorante fluorescente che si lega alle strutture del foglio beta dell'amiloide. Un aumento della fluorescenza rispetto al basale indica la presenza di amiloidi nel surnatante della coltura.

Protocollo

1. Analisi dei surnatanti citotossici

1. Per eseguire un test della tioflavina T (ThT), utilizzare la fluorescenza ThT per quantificare gli amiloidi nei surnatanti. Per queste misurazioni, utilizzare surnatanti sterilizzati con filtro.
   1. Preparare una soluzione madre (50x) di ThT sospendendo 8 mg di ThT in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dopo la miscelazione, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere il particolato.
   2. Per le misurazioni, aggiungere 20 μL di ThT a 1 mL di PBS in una cuvetta spettrofotometrica da 1 mL. Posizionare il campione diluito in uno spettrofluorimetro.
   3. Misurare l'emissione di fluorescenza di base utilizzando l'eccitazione di 425 nm e scansionando l'emissione di fluorescenza da 450-575 nm con incrementi di 2 nm.
   4. Esegui una scansione time-lapse utilizzando l'eccitazione a 425 nm e l'emissione a 482 nm, con dati acquisiti ogni 0,2 s per 60 s.
   5. I primi 20 s della scansione time-lapse misurano la fluorescenza nella cuvetta vuota. A 20 s, mettere in pausa la scansione e aggiungere 10 μl di surnatante sterilizzato con filtro alla cuvetta. Mescolare la cuvetta per inversione e quindi riposizionarla nello spettrofluorimetro.
   6. Riprendere la scansione basata sul tempo, acquisendo gli ultimi 40 s di dati.
   7. Al termine della scansione time-lapse, eseguire una scansione finale dello spettro di emissione della fluorescenza utilizzando impostazioni identiche, come descritto nel passaggio 1.3.

Materiali