Saggio di coincubazione per lo studio delle interazioni competitive tra ceppi batterici

Abstract

Fonte: Speare, L., et al. Saggio di coincubazione per quantificare le interazioni competitive tra isolati di Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un saggio di co-incubazione utilizzato per studiare come i ceppi batterici competono in un ambiente condiviso. È ampiamente applicato in microbiologia per identificare i meccanismi, come l'uccisione dipendente o indipendente dal contatto, che guidano queste interazioni.

Protocollo

1. Ceppi in cocubazione (Figura 1B, C)
   1. Mescolare il ceppo di riferimento e il ceppo concorrente in un rapporto 1:1 (v/v) aggiungendo 100 μL di ciascun ceppo (normalizzato a OD 1,0) a una provetta da centrifuga da 1,5 mL etichettata. Come controllo, mescolare la deformazione di riferimento con una versione differenziata di se stessa (deformazione di riferimento pVSV102 + deformazione di riferimento pVSV208). Questo controllo è necessario per una successiva analisi statistica per determinare se la presenza di un ceppo concorrente influisce sulla crescita del ceppo di riferimento. Agitare la coltura a ceppo misto per 1-2 s.
      NOTA: Questo passaggio potrebbe richiedere un'ottimizzazione in quanto il rapporto iniziale può influire in modo significativo sui risultati e potrebbe essere necessario regolarlo.
   2. Ripetere il passaggio 1 per ogni replica biologica. Dopo aver completato questa fase, dovrebbero esserci un totale di otto provette a ceppo misto: quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento marcati in modo differenziale (controllo) e quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento e concorrenti con marcatura differenziale (sperimentali).
   3. Posizionare 10 μl di ciascuna miscela di controllo e sperimentale su piastre di Petri contenenti agar LBS; Questi punti di coltura saranno utilizzati per la microscopia a fluorescenza dopo l'incubazione.
   4. Lasciare asciugare completamente le macchie sul banco fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito nell'agar e incubare le piastre di Petri a 24 °C per 24 ore. Sono necessarie almeno 15 ore per i ceppi di V. fischeri marcati con pVSV102 e pVSV208 per crescere fino a una densità cellulare sufficientemente elevata da visualizzare rispettivamente la proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina fluorescente rossa (RFP) a livello di popolazione utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza. Qui, utilizziamo un'incubazione di 24 ore per l'imaging di punti misti.
      NOTA: È importante utilizzare piatti non troppo umidi o troppo asciutti. Se le piastre sono troppo umide, i punti di cocubazione non verranno assorbiti nella piastra di agar; Evitare di utilizzare piatti versati lo stesso giorno. Se le piastre sono troppo asciutte, possono formarsi piccole onde o crepe sulla superficie dell'agar, rendendo le macchie di cocubazione di forma irregolare.

Risultati

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra il saggio di coincubazione. (A) I ceppi batterici che ospitano pVSV102 (ceppo di riferimento indicato come Ceppo di riferimento o R.S.) o pVSV208 (ceppo concorrente indicato come Ceppo Comp...

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