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1. Saggio di placcatura
NOTA: Il saggio di piastratura misura la concentrazione di cellule in grado di generare un'unità formante colonia (CFU) nei campioni di coltura. Questa procedura rivela la velocità con cui una cellula si divide in due cellule vitali e consente il rilevamento di arresti di divisione cellulare (ad esempio, un aumento del tempo di generazione batterica della lisi cellulare).
- Preparare diluizioni seriali di 10 volte fino a 10-7 dei 200 μL di campione di coltura in terreno fresco. Piastra 100 μl della diluizione appropriata su piastre di agarosio Luria-Bertani (LB) non selettive per ottenere tra 3-300 colonie dopo incubazione notturna a 37 °C.NOTA: La diluizione seriale in terreno fresco deve essere eseguita rapidamente per limitare le divisioni batteriche. In alternativa, i ricercatori potrebbero prendere in considerazione l'utilizzo di una soluzione salina senza una fonte di carbonio per prevenire le divisioni cellulari durante il processo di diluizione.
- Il giorno successivo, contare il numero di colonie per determinare la concentrazione di cellule vitali (CFU/mL) in ciascun campione di coltura. Tracciare le CFU/mL in funzione del tempo per colture cellulari non trattate e trattate.
2. Citometria a flusso
NOTA: La sezione seguente descrive la preparazione di campioni cellulari per l'analisi della citometria a flusso. Questa tecnica di analisi rivela la distribuzione delle dimensioni cellulari e il contenuto di DNA per un gran numero di cellule. Quando possibile, si consiglia di elaborare immediatamente i campioni di citometria a flusso. In alternativa, i campioni possono essere conservati su ghiaccio (per un massimo di 6 ore) e analizzati contemporaneamente alla fine della giornata, una volta eseguita la placcatura e l'imaging al microscopio.
- Diluire i 250 μl di campione di coltura per ottenere 250 μl a una concentrazione di ~15.000 cellule/μl (corrispondente a un OD600nm ~0,06) in terreno fresco a 4 °C.
NOTA: L'incubazione sul ghiaccio limiterà la crescita e la modificazione morfologica delle cellule. In alternativa, l'utente potrebbe prendere in considerazione l'esecuzione della fissazione delle cellule in etanolo al 75%, come solitamente raccomandato per la citometria a flusso. - Per la colorazione del DNA, mescolare il campione batterico con una soluzione da 10 μg/mL di colorante fluorescente al DNA (rapporto 1:1) e incubare al buio per 15 minuti prima di analizzare il campione.
- Passare il campione nel citometro a flusso con una portata di ~120.000 cellule/min. Acquisisci la luce diffusa in avanti (FSC) e laterale (SSC) e il segnale di fluorescenza del colorante fluorescente DNA (FL-1) con le impostazioni appropriate.
- Tracciare gli istogrammi di densità cellulare FSC e FL-1 per rappresentare la distribuzione delle dimensioni cellulari e del contenuto di DNA nella popolazione cellulare.