Evoluzione adattiva dei batteri utilizzando un sistema di coltura microbica a microgocce

Abstract

Fonte: Jian, X., et al., Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura di microgoccioline microbiche (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'uso di un sistema di coltura di microgoccioline microbiche per guidare l'evoluzione adattativa dei batteri verso la tolleranza al metanolo. Mescolando colture batteriche ingegnerizzate con un mezzo di stress ad alto contenuto di metanolo e segmentandole in microgoccioline, il sistema seleziona i mutanti che mostrano una crescita migliorata sotto stress da metanolo. Attraverso cicli di arricchimento iterativo e isolamento delle colonie, i ceppi batterici adattati al metanolo vengono coltivati per ulteriori analisi o applicazioni.

Protocollo

Evoluzione adattiva in MMC

1. Preparazione per la soluzione batterica iniziale
   1. Seguire le relative normative standard per preparare le speciali piastre liquide e solide per il MeSV2.2 e l'autoclave a 121 °C per 15 min.
   2. Coltivare il MeSV2.2 utilizzando la piastra solida (diametro = 90 mm) in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 72 ore. Quindi, prelevare una colonia indipendente e coltivarla in un pallone da 50 mL con 10 mL di speciale mezzo liquido in un incubatore ad agitazione (200 giri/min) a 37 °C per 72 ore.
   3. Diluire la soluzione di MeSV2.2 in coltura con il terreno fino a un OD₆₀₀ di 0,1-0,2 (assicurarsi che il volume totale non sia inferiore a 10 mL) e continuare a coltivarla nel pallone per 5 ore per ottenere la soluzione batterica iniziale.
      NOTA: Il MeSV2.2 è un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo. Lo speciale mezzo liquido contiene 500 mmol/L di metanolo, che è un forte stress per MeSV2.2, con conseguente crescita molto lenta.
2. Inizializzare MMC.
3. Estrarre due flaconi di reagenti sterilizzati, uno dei quali è per la soluzione batterica iniziale e l'altro è per il terreno fresco. Iniettare la soluzione batterica iniziale (5 mL), il terreno fresco (12-15 mL) e l'olio MMC nei flaconi dei reagenti.
   NOTA: Poiché l'evoluzione adattativa è un processo a lungo termine che coinvolge più sottocoltivazioni, conservare quanto più terreno fresco possibile in MMC. Il mezzo non può essere reintegrato durante l'esperimento.
4. Installare i due flaconi di reagenti in MMC. Installare quello per la soluzione batterica iniziale tra il connettore C2 e O2 e l'altro per il mezzo fresco tra il connettore C4 e O4.
5. Fare clic su ALE per scegliere la funzione dell'evoluzione adattiva (Figura 1B). Nell'interfaccia di impostazione dei parametri, attivare l'interruttore di rilevamento OD.

6. Impostare il numero su 50, la lunghezza d'onda su 600 nm, la concentrazione su 0%, il tipo come tempo, il parametro su 30 ore e le ripetizioni su 99. Fare clic su Avvia per avviare la generazione di droplet. Ci vorranno circa 25 minuti.
   NOTA: Qui, "Concentrazione" si riferisce alla concentrazione massima di fattori chimici per l'evoluzione adattativa. Per goccioline diverse, è possibile introdurre in MMC diverse concentrazioni di fattori chimici per fornire diverse condizioni di crescita. Calcolare le concentrazioni introdotte utilizzando la seguente equazione:

   

   Qui, "C" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici introdotti nelle goccioline; "a" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici nei flaconi dei reagenti tra il connettore C4 e O4; "b" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici nei flaconi dei reagenti tra il connettore C6 e O6; e "i" si riferisce alla concentrazione disponibile. Ci sono otto concentrazioni disponibili in MMC. Poiché il fattore chimico qui ha una singola concentrazione (500 mmol/L metanolo) ed è uno degli ingredienti del mezzo, qui è installato un solo flacone di reagente contenente il fattore chimico e la concentrazione è impostata su 0%. Il tipo si riferisce alla modalità di sub-coltivazione, che si divide in tre tipi: modalità tempo, modalità valore OD e modalità fluorescenza. Il primo significa coltivare le goccioline per un tempo fisso e poi sub-coltivare, mentre gli ultimi due significano coltivare le goccioline a un valore OD/intensità di fluorescenza predefinito e quindi sub-coltivare. Il parametro si riferisce al relativo parametro richiesto quando si sceglie una modalità di sub-coltivazione. Le ripetizioni si riferiscono al numero di sottocoltivazioni.

7. Rimuovere il flacone del reagente posizionato tra i connettori C2 e O2.
8. Osservare se i valori massimi di OD delle goccioline durante ogni periodo di sub-coltivazione sono aumentati in modo significativo. Se l'aumento si verifica e soddisfa i requisiti dell'esperimento, fare clic sul pulsante Esportazione dati per esportare i dati OD.
   NOTA: In questo caso, il periodo di sub-coltivazione dipende dal parametro. Ad esempio, quando si imposta Tipo su Tempo e Parametro su 30 ore, il periodo di sottocoltivazione è di 30 ore. Durante ogni periodo di sub-coltivazione, ci sono valori massimi di OD delle goccioline. Stimare se l'evoluzione adattativa soddisfa i requisiti dell'esperimento aumentando i valori massimi di OD (l'aumento dipende dall'effettivo processo di coltivazione del ceppo, ad esempio, aumentato di oltre il 20%). ATTENZIONE: Prestare attenzione se il terreno fresco immagazzinato è esaurito. Se l'aumento significativo non si è verificato anche dopo l'esaurimento del terreno, estrarre le goccioline che crescono meglio ed eseguire un nuovo ciclo di evoluzione adattativa.
9. Estrarre le goccioline target dalla MMC.
   1. Fare clic sul pulsante Screening per scegliere la funzione di estrazione delle goccioline (Figura 1C). Scegli l'opzione Raccogli, fai clic sul numero di goccioline target, quindi fai clic su OK.
      NOTA: Lo screening delle goccioline include "Raccogli", "Scarta" ed "Estrai soluzione di semi". "Estrarre la soluzione di semi" significa raccogliere le goccioline rimanenti dopo l'operazione di subcoltivazione.
   2. Attendi che la finestra pop-up visualizzi il messaggio "Estrarre il connettore rapido CF e inserirlo nel tubo EP". Inserire il connettore rapido CF nella provetta della microcentrifuga per la raccolta in base al prompt del software, quindi fare clic su OK (Figura 2D).
   3. Dopo 1-2 minuti, l'interfaccia del software visualizzerà una nuova finestra che richiede "Reinserire il connettore e fare clic su OK se hai finito". Quindi, reinserire il connettore rapido CF e fare clic su OK per continuare l'esecuzione di MMC (Figura 2D).
      NOTA: Dopo che tutte le goccioline target sono state raccolte, l'MMC continuerà a coltivare le goccioline rimanenti. Se la coltivazione non è necessaria, cliccare su Stop per terminare direttamente l'operazione.
   4. Estrarre la gocciolina con una pipetta da 2,5 μL, versarla sulla piastra di agarosio da 90 mm e distribuirla uniformemente con un'asta di diffusione triangolare in vetro con una lunghezza laterale di 3 cm. Quindi, coltivarlo in un'incubatrice a temperatura costante di 37 °C per 72 h.
   5. Raccogliere 3-5 colonie indipendenti e coltivarle separatamente nei matracci da 50 mL con 10 mL di terreno fresco in un incubatore a scuotimento (200 giri/min) a 37 °C per 48-72 h. Seguire le normative standard correlate per conservare la soluzione di batteri coltivati nella provetta di glicerolo per gli esperimenti successivi.

Risultati

Figura 1: Interfaccia del software operativo di MMC. (A) L'interfaccia principale del software. (1) Temperatura nella camera operativa. (2) Valore del segnale fotoelettrico del riconoscimento delle goccioline. Quando la...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Metanolo	MACKLIN	M813895	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Sistema di coltura microbica a microgocce (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Esecuzione della determinazione della curva di crescita e dell'evoluzione adattiva. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Chip microfluidico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Per varie operazioni di droplet. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Olio MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La fase oleosa per la microfluidica delle goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Petri	Corning Incorporated	90 millimetri	Per la preparazione di terreni solidi
Pipetta	Eppendorf	2,5 μl, 10 μl, 100μl, 1000μl	Per la manipolazione di liquidi
Raccordo rapido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Per il collegamento di ogni giunto. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Flacone di reagenti	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Campionamento e conservazione di soluzioni batteriche e reagenti. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Agitare il pallone	Unione-Biotecnologie	50 ml	Per la coltivazione microbica
Incubatore a scuotimento	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	CIELO-210 2B	Per la coltivazione microbica in pallone a shake
Streptomicina solfato	Distretto di Solarbio	S8290	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Siringa	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 ml	Aspirare il liquido e iniettarlo nel flacone del reagente
Ago per siringa	Ferramenta OUBEL	22 grammi	Il diametro interno è di 0,41 mm e il diametro esterno è di 0,71 mm.