Preparazione di una piastra microfluidica con cellule batteriche

Abstract

Fonte: Sutlief, A. L., et al. Analisi della cellula viva dello stress di taglio su Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema microfluidico automatizzato ad alta produttività. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra la preparazione di una piastra microfluidica per studi dello stress di taglio nelle colture batteriche. Dopo aver primizzato i canali con il substrato, le cellule batteriche vengono introdotte nel canale sperimentale e incubate per l'attacco. I mezzi residui e la coltura vengono rimossi per preparare il sistema ai successivi esperimenti di sforzo di taglio.

Protocollo

1. Preparazione ai media

Prepara un substrato minimo (MM) con 0,25% di glucosio. Per produrre 1 L di MM con 0,25% di glucosio, aggiungere 200 mL di soluzione salina sterile M9, 2 mL di solfato di magnesio sterile da 1 M (MgSO₄), 100 μL di cloruro di calcio sterile da 1 M (CaCl₂) e 12,5 mL di glucosio sterile al 20% (p/v) in acqua (dH₂O) a un volume finale di 1 L.
Trasferire i mezzi necessari in una bottiglia sterile utilizzando tecniche sterili. Prepara la quantità richiesta a seconda del numero di canali utilizzati. Tipicamente, ogni canale richiede 200 μL per l'innesco, 300 μL per la semina e 1300 μL per l'esperimento di 24 ore.
Metti la bottiglia in un incubatore o in un bagno d'acqua impostato alla temperatura sperimentale. Il substrato dovrebbe essere alla temperatura dell'esperimento prima dell'uso per evitare la formazione di bolle nei microcanali.

2. Preparazione di una coltura notturna e sperimentale del ceppo PA01 di Pseudomonas aeruginosa che esprime una proteina fluorescente verde potenziata (PA01-EGFP).

Mettere 15 mL di substrato sperimentale in una fiaschetta sterile e inoculare con una o due colonie da una piastra agar striata con PA01-EGFP. Espandi la coltura per 12-16 ore su un incubatore/tavolo shaker a 37 °C e 180-220 rpm.
Misura il OD₆₀₀ della coltura notturna. Quando il OD₆₀₀ è superiore a 0,80, diluire la coltura notturna fino a un OD finale di 0,8 usando MM fresco. Posizionare la coltura sperimentale in un incubatore o in bagno-maria a 37 °C fino a quando non è necessario per la semina dei canali microfluidici. Controlla nuovamente l'OD₆₀₀ immediatamente prima della semina per assicurarti che non sia cambiato significativamente rispetto al target OD₆₀₀, 0,8 in questo caso.

3. Avvio delle attrezzature

Configura la stazione di sistema secondo la guida utente, simile alla configurazione della Figura 1. Per evitare errori nella connessione dello strumento al software, accendi lo strumento nel seguente ordine:
Stazione di lavoro PC
Modulo di fluorescenza. Assicurati che l'otturatore fluorescente sia ACCESO (luce blu vicino al pulsante dell'otturatore acceso)
Controller hardware
Controllore del sistema di imaging (vedi Tabella dei materiali)
Fotocamera CCD
Stazione di imaging (microscopio)
NOTA: La temperatura della piastra riscaldata deve essere regolata alla temperatura sperimentale desiderata.
Avvia l'applicazione di controllo e inserisci il numero della targa situato sull'etichetta laterale della placca.
NOTA: Dopo l'avvio dell'applicazione di controllo, ci saranno due finestre applicative separate, una per il software che controlla il microscopio/software di imaging e una per il modulo di controllo che controlla la pompa e l'interfaccia della piastra del pozzo.

4. Innesco e semina della piastra microfluidica

NOTA: Il priming, la semina, l'attacco batterico e la crescita sono illustrati nella Figura 2.

Rimuovi la piastra microfluidica a 48 pozzi dal packaging facendo attenzione a non toccare la superficie del vetro sul fondo della placca. Pulisci bene il vetrino sul fondo della piastra con un fazzoletto per lenti, un panno senza pelucchi o una salvietta a bassa temperatura.
Per primerare i canali microfluidici, si pipettare 200 μL di 37 °C MM nel pozzo di uscita, facendo attenzione a evitare bolle. Posiziona la piastra nella fase della piastra e strofina l'interfaccia con etanolo, lasciandola asciugare, prima di sigillarla sulla piastra principale.
In modalità manuale sul modulo di controllo, impostare Fluido come
Luria-bertani (LB) a 37 °C e taglio massimo a 5,00 dyne/^{cm 2}. Clicca sui pozzi di uscita per attivare il flusso dall'uscita al pozzo di ingresso, preparando i canali. Dopo i 5 minuti di preparazione, interrompi il flusso per prepararti alla semina. Rimuovere con cura la piastra dallo stadio e pipetta i residui di supporto dall'uscita, ma non rimuovere alcun mezzo dal cerchio interno che conduce ai canali microfluidici.
Per inserire i canali sperimentali, prima si pipettano 300 μL di MM nel pozzo di ingresso, seguite da pipettare 300 μL della coltura batterica nel pozzo di uscita nel pozzo di uscita. Riposiziona la piastra nella fase di piastra e assicurandoti di pulire l'interfaccia prima di metterla sulla piastra stessa.
Sul Modulo di Controllo, concentrarsi su un singolo canale utilizzando il feed della telecamera dal vivo dopo aver posizionato lo stadio a piastra sul palco del microscopio. Durante il monitoraggio visivo tramite il feed live, riprendere il flusso a 1,00-2,00 dyne/cm² per circa 2-4 s per permettere alle cellule di entrare nel canale sperimentale, ma non nei canali serpentini. Lascia la piastra sul palco a temperatura controllata per 1 ora per permettere l'attacco della cella. Durante l'incubazione di un'ora, il modulo di controllo e il software Montage possono essere configurati per l'autorun.
NOTA: Il tempo necessario per la semina varia a seconda del mezzo e dell'organismo, quindi dovrebbe essere monitorato attentamente dal feed vivo fino a quando non viene ottimizzato e utilizzato come intervallo di tempo generale. La semina lungo tutta la lastra può variare, il che richiederebbe più tempo affinché l'applicazione fluisca verso determinate colonne di canali per una semina completa.
Dopo il periodo di attacco, rimuovere delicatamente la piastra dallo stadio e pipettare prima i batteri dall'uscita, evitando di disturbare il canale. Con una nuova punta di pipetta, rimuovi il materiale dai pozzi di ingresso.

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Risultati

Figura 1: Singoli componenti del Sistema Microfluidico. I singoli componenti sono elencati da sinistra a destra: 1. Telecamera CCD, 2. Microscopio capovolto ad alta risoluzione con palco automatico, modulo di fluorescenza automatizzato e mo...