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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Infezione sperimentale da M. marinum con iniezione intraperitoneale
- Pipetta una goccia da 5 μL della soluzione batterica diluita su un pezzo di pellicola parafilm e tira la goccia in un ago di insulina da 30 G.
- Usa pesci selvatici di 5–8 mesi e pesci mutanti rag1−/−hu1999 per l'esperimento. Anestesiare i pesci zebra adulti nell'acqua dell'acquario con estere etilico di acido 3-aminobenzoico allo 0,02% (pH 7,0). Posiziona il lato ventrale del pesce in una fessura su una plastica umida e schiumosa.
NOTA: I pesci mutanti rag-/- non sono in grado di sottoporsi a ricombinazione somatica e producono cellule T e B funzionali. - Iniettare l'ago tra le pinne pelviche con un angolo di circa 45°. Mantieni l'ago aperto verso l'alto per osservare che l'intera apertura sia all'interno della cavità addominale. Inietta lentamente la sospensione batterica e rimuovi con cura l'ago.
NOTA: Nel caso in cui il tracciante rosso fuoriuscisse dal pesce durante l'iniezione, escludere il pesce dall'esperimento. - Subito dopo l'iniezione, trasferire il pesce in una vasca di recupero con acqua fresca.
- Preleva campioni della sospensione batterica su piastre 7H10 ogni 15 minuti dall'aliquota batterica in uso e incuba il batterio a 29 °C per 5 giorni, verificando la dose di infezione contando le colonie sulle piastre.
- Controllate regolarmente il benessere dei pesci e sopponete l'eutanasia di qualsiasi pesce con sintomi di infezione con una concentrazione superiore allo 0,02% di estere etilico di acido 3-aminobenzoico (pH 7,0).
NOTA: Circa il 7% degli adulti di pesce zebra infettati con 34 ± 15 CFU e il 30% dei pesci zebra infettati con 2029 ± 709 CFU avranno già avuto sintomi entro 8 settimane19. I sintomi possono includere nuoto anomalo, mancanza di risposta al tatto, ansimi, edema o eccessione osservabile. - Mantenere il pesce zebra secondo gli standard comuni