Valutazione del ruolo dell'immunità dell'ospite nelle infezioni micobatteriche utilizzando un modello di pesce zebra

Abstract

Fonte: Luukinen, H., et al. Modellazione della tubercolosi negli adulti zebra infettati da Mycobacterium marinum . J. Vis. Esp. (2018).

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Infezione sperimentale da M. marinum con iniezione intraperitoneale

1. Pipetta una goccia da 5 μL della soluzione batterica diluita su un pezzo di pellicola parafilm e tira la goccia in un ago di insulina da 30 G.
2. Usa pesci selvatici di 5–8 mesi e pesci mutanti rag1−/−hu1999 per l'esperimento. Anestesiare i pesci zebra adulti nell'acqua dell'acquario con estere etilico di acido 3-aminobenzoico allo 0,02% (pH 7,0). Posiziona il lato ventrale del pesce in una fessura su una plastica umida e schiumosa.
   NOTA: I pesci mutanti rag-/- non sono in grado di sottoporsi a ricombinazione somatica e producono cellule T e B funzionali.
3. Iniettare l'ago tra le pinne pelviche con un angolo di circa 45°. Mantieni l'ago aperto verso l'alto per osservare che l'intera apertura sia all'interno della cavità addominale. Inietta lentamente la sospensione batterica e rimuovi con cura l'ago.
   NOTA: Nel caso in cui il tracciante rosso fuoriuscisse dal pesce durante l'iniezione, escludere il pesce dall'esperimento.
4. Subito dopo l'iniezione, trasferire il pesce in una vasca di recupero con acqua fresca.
5. Preleva campioni della sospensione batterica su piastre 7H10 ogni 15 minuti dall'aliquota batterica in uso e incuba il batterio a 29 °C per 5 giorni, verificando la dose di infezione contando le colonie sulle piastre.
6. Controllate regolarmente il benessere dei pesci e sopponete l'eutanasia di qualsiasi pesce con sintomi di infezione con una concentrazione superiore allo 0,02% di estere etilico di acido 3-aminobenzoico (pH 7,0).
   NOTA: Circa il 7% degli adulti di pesce zebra infettati con 34 ± 15 CFU e il 30% dei pesci zebra infettati con 2029 ± 709 CFU avranno già avuto sintomi entro 8 settimane19. I sintomi possono includere nuoto anomalo, mancanza di risposta al tatto, ansimi, edema o eccessione osservabile.
7. Mantenere il pesce zebra secondo gli standard comuni

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mycobacterium marinum	Collezione della Cultura di Tipo Americano	ATCC 927
Agar Middlebrock 7H10	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Arricchimento OADC di Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 media	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Arricchimento ADC di Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Compresse saline tamponate con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Rosso fenolico	Sigma-Aldrich	P3532
Ago da 27 G	Henke Sass Lupo	4710004020
1 mL di siringa	Henke Sass Lupo	4010.200V0
Ago di insulina Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Estere etilico dell'acido 3-aminobenzoico (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	A5040