Modello in vitro a flusso parallelo a placche per studiare l'adesione batterica in una biopsia tissutale

Abstract

Fonte: Ditkowski, B., et al. Un modello in vitro di un sistema di perfusione a placche parallele per studiare l'aderenza batterica ai tessuti dell'innesto. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra il metodo di utilizzo di una camera di flusso a piastre parallele per perfondere batteri marcati con fluorescenza su tessuti di innesto vascolare, consentendo un'analisi controllata dell'adesione batterica e della patogenesi precoce in condizioni di flusso di taglio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.1. Esperimenti di perfusione in vitro utilizzando una camera di flusso a piastre parallele

1. Montare biopsie tissutali di 10 mm di diametro e dello stesso spessore in un sistema di camera di flusso con la superficie interna rivolta verso l'alto per entrare in contatto con la sospensione batterica.
   NOTA: Lo stesso spessore del tessuto attraverso i vari innesti garantisce che la stessa altezza del tessuto venga raggiunta nel canale, permettendo il flusso laminare in tutte le condizioni. Tutti gli elementi della camera di flusso sono presentati e descritti nella Figura 1.
   1. Per iniziare il protocollo, posizionare il pezzo di tessuto rotondo tra un vetrino del microscopio con una perforazione circolare da 8 mm e una guarnizione in gomma.
      NOTA: Il vetrino del microscopio possiede la pellicola inferiore ultrasottile per permettere la generazione del foro da 8 mm. Insieme al foglio di gomma, fissa il tessuto per permettere il contatto diretto tra il campione e il mezzo corrente e previene anche la lussazione della biopsia durante l'esperimento. La superficie del tessuto investigato, esposta al flusso (diametro minore), non può essere manipolata dalle pinze.
      1. Inserisci il portafoglio con il fazzoletto nella foglia di guarnizione che è inserita nel telaio metallico inferiore della camera.
      2. Fissa il telaio metallico superiore con la corrispondente lastra di guarnizione sulla parte inferiore della camera con il supporto del tessuto precedentemente inserito. Successivamente monta l'intera camera con otto viti e dadi per viti. Assicurati che l'altezza della camera sia sempre la stessa tra i trapianti.
         NOTA: L'altezza della camera deve essere determinata sempre al momento della serratura delle viti. Usa un calibro o un righello.
2. Collega la camera di flusso con una pompa peristaltica e il serbatoio del fluido con i tubi.
3. Perfondere i tessuti con sospensioni di 10 CFU^/mL (verificato tramite conteggio delle unità formanti di colonie e correlati alle misurazioni OD₆₀₀ (densità ottica)) in PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) con uno stress di taglio di 3 dyne/cm² (dyne per unità di pressione centimetrica quadrata) tramite la pompa peristaltica (portata 4 mL/min) per 1 ora utilizzando un serbatoio batterico da 400 mL (progettazione interna, Figura 1) condizionata a 37 °C utilizzando un termostato a piastre (Tabella dei materiali).
4. Ricircolare continuamente la sospensione batterica da 100 mL utilizzando lo stesso serbatoio di raccolta.
5. Dopo la perfusione, smontare la camera per rilasciare l'innesto e lavare il pezzo di tessuto due volte con 4 mL di PBS in una piastra a 12 pozzi utilizzando lo shaker orbitale di laboratorio per 3 minuti ciascuno. Successivamente taglia la parte interna dell'innesto utilizzando un punzone per biopsia cutanea di diametro inferiore.
6. Inserire ogni biopsia tissutale in un tubo separato da 14 mL contenente 1 mL di NaCl sterile allo 0,9%. Etichetta il tubo come #1.
7. Distoglie i batteri dal tessuto utilizzando un bagno di sonicazione per 10 minuti (ampiezza = 100% e frequenza = 45 kHz).
   NOTA: Il distacco completo dei batteri dai trapianti tissutali dovrebbe essere valutato all'incubazione delle cerotti durante la notte a 37 °C in un mezzo liquido TSB (brodo di soia triptico), seguito da misurazioni OD₆₀₀ rispetto ai cerotti di controllo trattati con una soluzione priva di batteri.

Risultati

Figura 1: Immagine di un sistema di camera di flusso recentemente sviluppato (progettazione interna). A. Il flusso montato nella camera di flusso (1) di dimensioni LxLarghXLarghezza: 125 mm x 55 mm x 18 mm (le viti in combinazione con dadi ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cerotti pericardi bovini (BP), pericardio Peri-Guard Souple	Synovis Surgical Innovations, USA	PC-0404SN
Condotti della vena giugulare bovina (BJV)	condotto Contegra; Medtronic Inc, USA	M333105D001
Omoinnesto criopreservato CH	Banca Europea dell'Omoinnesto (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, USA	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
Albumina umana	Flexbumin; Baxter, Belgio	BE171464LOT:16G12C
Brodo di soia triptico (TSB)	Fluka, Steinheim, Germania	22092-500G
Brodo per infusione cardiaca (BHI)	Fluka	53286-500G
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Carbossikfluoresceina Estere N-idrossisuccinimide (CF)	Sigma-Aldrich, Germania	21878-100MG-F
Pompa peristaltica (MODELLO ISM444B)	Standard Ismatec BVP-Z; Cole Parmer, Wertheim, Germania	631942-2
Bagno di sonicazione	Purificatore a ultrasuoni VWR; VWR, Radnor, Pennsylvania	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
Supporto antifade d'oro ProLong	Invitrogen di ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF - acqua ultrapura - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Vetri microscopici - Camere di coltura tissutale (1 pozzo)	Sarstedt	94.6140.102
1-pozzo su Lumox staccabile	Sarstedt	94.6150.101
Acciaio inossidabile - lame chirurgiche	Swann-Morton	311
Tubo in silicone Tygon, diametro diametrale x 1/4" di diametro	Cole-Parmer	EW-95702-06	Intervallo di temperatura: –80-200°CSterilizza: Con ossido di etilene, irradiazione gamma o autoclave per 30 minuti, 15 psi di pressione
Tubi PharMed BPT	Saint-Gobain	AY242012	Autoclavabile 30 min a 121°C
Tubi Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Termostato	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz