Questo protocollo descrive una procedura per studiare la respirazione dei mitocondri isolati da muscolo scheletrico. Questo metodo è stato adattato da Scorrano Et al. (2007). La procedura di isolamento dei mitocondri richiede circa 2 ore. La respirazione mitocondriale può essere completata in circa 1 ora.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono organelli controllare la vita e la morte della cellula. Partecipano in chiave reazioni metaboliche, sintetizzare la maggior parte di ATP, e regolano una serie di cascate di segnalazione 2,3. Ricercatori passati e presenti hanno mitocondri isolati da tessuti ratti e topi, come fegato, cervello e cuore 4,5. Negli ultimi anni, molti ricercatori si sono concentrati sullo studio di funzione mitocondriale dei muscoli scheletrici.
Qui, descriviamo un metodo che abbiamo usato con successo per l'isolamento dei mitocondri da muscoli scheletrici 6. La nostra procedura richiede che tutti i buffer e reagenti sono freschi e hanno bisogno di circa 250-500 mg di muscolo scheletrico. Sono stati studiati i mitocondri isolati da gastrocnemio ratto e nel topo e il diaframma e muscoli extraoculari ratto. Concentrazione di proteina mitocondriale viene misurata con il saggio Bradford. E 'importante che i campioni mitocondriale essere tenuti ghiacciata durante la preparazione e che gli studi funzionali da eseguire in un tempo relativamente breve (~ 1 ora). Respirazione mitocondriale è misurata con polarografia con un elettrodo di Clark-tipo (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. Taratura degli elettrodi ossigeno è un passo fondamentale di questo protocollo e deve essere effettuata ogni giorno. Mitocondri isolati (150 mcg) vengono aggiunti 0,5 ml di tampone sperimentale (EB). Stato 2 respirazione inizia con aggiunta di glutammato (5mm) e malato (2,5 mm). Poi, adenosina difosfato (ADP) (150 mM) è stato aggiunto a iniziare 3. Oligomicina (1 micron), un bloccante sintasi ATPasi, viene utilizzato per stimare lo stato 4. Infine, carbonile cianuro p-[trifluoromethoxy]-fenil-idrazone (FCCP, 0,2 mM) si aggiunge a measurestate 5, o sganciati respirazione 6. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR), il rapporto tra stato 3 allo stato 4, viene calcolato dopo ogni esperimento. Un RCR ≥ 4 è considerata come prova di una preparazione valida mitocondri.
In sintesi, vi presentiamo un metodo per l'isolamento dei mitocondri vitali da muscoli scheletrici che può essere utilizzato in biochimica (ad esempio, l'attività enzimatica, immunolocalizzazione, proteomica) e studi funzionali (respirazione mitocondriale).
Protocollo
1. Preparazione del buffer
- Accendere 5804R centrifuga e impostare a 4 ° C. Accendere bagnomaria Isotemp 3006D e impostare a 37 ° C.
- Preparare le seguenti soluzioni prima di isolamento del muscolo:
- PBS: sciogliere tampone fosfato (PBS) compresse in acqua distillata (5 compresse / litro). Mescolare bene.
- PBS + 10 mM EDTA: Per preparare un 100 ml di soluzione, aggiungere 2 ml di 500 mM EDTA a 98 ml di PBS.
- 8X Mitocondri buffer: 10,28 g di saccarosio per una concentrazione finale di 0,6 M, 400 mg di acidi grassi liberi albumina di siero bovino (BSA) per una concentrazione finale del 0,8%, 2,08 g di HEPES per una concentra....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Vi presentiamo un protocollo per isolare i mitocondri praticabile da muscoli scheletrici. Se il rendimento è un problema, il protocollo può essere modificato tramite l'incubazione del muscolo isolato in 5 ml di tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% per 30 minuti in ghiaccio. Per assicurare la completa digestione con tripsina muscolare, il muscolo ha bisogno di essere completamente tritato. Dopo i 30 minuti di incubazione, la soluzione PBS/10mM tripsina EDTA/0.01% deve essere completamente sostituita con 3 ml di buffer di iso.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Eye Institute (R01 EY12998) per FH Andrade.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Miscela di 95% CO2 / 5% O2 | Fornitore locale di gas | ||
| Adenosina 5′-difosfato sale sodico | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Carta Blue Rizla | Hansatech | 890101 | |
| Saggio proteico di Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcianuro p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuga 5804R | Eppendorf | ||
| Azoto compresso | Fornitore locale di gas | ||
| D-mannitolo | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Acido etilene-glicole-bis-tetraacetico (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Albumina sierica bovina con acidi grassi liberi | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Acido glutammico | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| Sal sodica di HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Ratti Sprague Dawley maschi | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Acido malico | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuga | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Disco elettrodo per ossigeno | Hansatech | S1 | |
| Ossigrafo | Hansatech | ||
| Software Ossigrafo Plus V1.01 | Hansatech | ||
| Misuratore di pH | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Fosfato di potassio | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Omogeneizzatori Potter-Elvehjem | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| Membrana in PTFE (0.0125mm × 25mm) | Hansatech | S4 | |
| Piattaforma trapano SKIL 3320 | Negozio di ferramenta | ||
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S5016 |
Riferimenti
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
