Summary
וידאו זה מראה טכניקה יעילה עבור מבדל ו בניתוח שונות שקוף למחצה מבנים בגוף האדם זגוגי בעיניים פוסט מורטם.
Abstract
זגוגי הוא ברור אופטית, תאי מטריקס collagenous הממלא את פנים העין overlies הרשתית. 1,2 אינטראקציות בין חריגה substructures הזגוגית לבין הרשתית ביסוד vitreoretinal מחלות שונות, כולל דמעה התנתקות הרשתית, כווץ מקולרי, חור מקולרי, גיל ניוון מקולרי הקשור, המתיחה vitreomacular, vitreoretinopathy שגשוג, רטינופתיה סוכרתית שגשוג, ו vitreoretinopathies בירושה. 1,2 ההרכב המולקולרי של substructures זגוגי אינו ידוע. מאז הגוף הזגוגי הוא שקוף עם גישה כירורגית מוגבל, זה כבר קשה ללמוד substructures שלה ברמה המולקולרית. פיתחנו שיטה להפריד ולשמר את הרקמות הללו לניתוח proteomic וביוכימיים. הטכניקה לנתיחה בסרטון זה ניסיוני מראה כיצד לבודד בסיס זגוגי, hyaloid הקדמי, הליבה זגוגי, ואת קליפת זגוגי מהעיניים שלאחר המוות האנושי. אחת ממדי SDS-PAGE מנתח של כל רכיב זגוגי הראו כי טכניקת לנתיחה שלנו הביא ארבעה פרופילים חלבון ייחודי המתאים מסד כל הגוף הזגוגי האדם. זיהוי של חלבונים מידור דיפרנציאלי יגלה מולקולות המועמד שבבסיס מחלות vitreoretinal שונים.
Protocol
1. מגזר Anterior Dissection.
- הקרנית היא להסיר תחילה ביצוע חתך בבית לימבוס לתא הקדמי באמצעות להב 15 ° (איור 1). ואז אחד הלהב של הקרנית-scleral מספריים מעוקל מוכנס לתוך החדר הקדמי. חתכים היקפיים מתקבלות הקרנית, הקדמי רק גובלת.
- 0.12 קוליברי מלקחיים ומספריים ווסטקוט משמשים לחתוך את איריס הקדמי circumferentially לגוף ריסי.
- גרעין העדשה מוסר עם מלקחיים קוליברי 0.12 או 15 ° להב (supersharp) לבין קליפת המוח ואת הקפסולה עם מלקחיים.
2. Core הזגוגיות שאיפה.
- מחט מד 23 על מזרק 5 סמ"ק מוכנס לתוך אמצע זגוגי (איור 1).
- כ 1 מ"ל או יותר של הליבה הזגוגית היא aspirated בעדינות.
- מדגם ממוקם אז צינור microfuge ולאחר מכן לתוך חנקן נוזלי.
3. Dissection Anterior Hyaloid.
- Hyaloid הקדמי נחשב טבעת שקופה למחצה על ידי התאמת האור מן האירוע אור צוואר אווז מיקרוסקופ. השאיפה הקודם של הליבה זגוגי המפריד בין hyaloid הקדמי של מבנים אחרים לצורך זיהוי קל.
- גיליון של רקמה אלסטית הוא שלף בזהירות מהגוף ריסי עם קוליברי או מלקחיים ההלבשה לגזור במספריים Vannas. תמרון זה חוזר על עצמו.
- מדגם ממוקם אז צינור microfuge ולאחר מכן לתוך חנקן נוזלי.
4. מאגר הזגוגיות Dissection.
- בעזרת מלקחיים 0.12 לייצב את כוס העין, מספריים ווסטקוט משמשים "פרח" את העין על ידי ובסך הכל ארבעה ברווחים שווים מתח להקלה על קיצוצים מהגוף ריסי לקראת ראש עצב הראייה.
- Plicata Pars גוף ריסי (איור 2) יוסר כל אחד הרביעים באמצעות מספריים ווסטקוט.
- הבסיס זגוגי נתפסת אז משני צדי serrata אורה עם מלקחיים על פלאנה Pars לבין הרשתית (איור 2).
- המתיחה רציף על בסיס זגוגי מוחל עם מלקחיים. חיתוך סדרתית עם ווסטקוט מספריים תמציות רקמה שקופה למחצה עם מראה "מחרוזת פנינים", כפי שהוא נכרת.
- מדגם ממוקם אז צינור microfuge ולאחר מכן לתוך חנקן נוזלי.
5. Cortex הזגוגיות הסרת.
- פלאנה Pars הוא נכרת מכל אחד הרביעים במספריים ווסטקוט ידי חיתוך את העלון כ 3 מ"מ אחורית של serrata אורה (איור 2).
- בין עלונים רקמות, קליפת זגוגי הוא מדמיין כסרט שקוף למחצה.
- סרט אלסטי נתפסת גם עם 0.12 מלקחיים או המוחזקים על ידי דבקות ספוג Weck-cel כירורגי. קליפת המוח היא זגוגי אז התרחקה מן הרשתית נכרת עם ווסטקוט מספריים (איור 1).
- מדגם ממוקם צינור microfuge ולאחר מכן לתוך חנקן נוזלי. כל הדגימות נשמרות ב -80 ° C עד מנוצלים לניסויים.
6. נציג תוצאות
דגימות רקמה יכול להיות מעובד על ידי מגוון של שיטות ניסויים ספציפיים. במקרה שלנו, דגימות נשלחו לניתוח חלבונים על ידי SDS-PAGE (איור 3).
באיור 1. חתך מבט של העין האנושית המתארות substructures שונים של הגוף הזגוגי. הזגוגית הקדמית ביותר היא שכבה collagenous דק הנקרא hyaloid הקדמי. ליבת זגוגי כוללת את כל האזור המרכזי של הגוף הזגוגי. חלק זה של הזגוגית היא מימית יותר בניגוד לבסיס זגוגי, שהוא צמיג מספיק כדי להיתפס על ידי מלקחיים, והוא מחובר היטב לגוף הרשתית ריסי הבסיס. הקפת הליבה הזגוגית היא מעטפת collagenous דק מאוד הנקרא קליפת זגוגי.
איור 2. האנטומיה בסיס הזגוגיות. בסיס מסד הזגוגית היא שקופה למחצה של הגוף הזגוגי ממוקם לאורך serrata אורה (חצים לבנים), המהווה את קו הגבול המפריד בין הגוף לבין הרשתית ריסי. הגבול הקדמי של הבסיס זגוגי משתרע על פני פלאנה Pars (קו לבן) של גוף ריסי. הגבול האחורי של הבסיס זגוגי מרחיב 2-3 מ"מ האחורי של serrata אורה (מקף לבן). כדי לבסס את הבלו זגוגי, מלקחיים המשמשים לתפוס את רקמות למשוך אותו מהגוף הרשתית ריסי הבסיס. מוגבה פעם, מספריים ווסטקוט משמשים לחתוך לאורך בסיס.
איור 3. אחת ממדי SDS-PAGE של אלמנטים גוף הזגוגיות. ריכוזי חלבון סך hyaloid הקדמי, בסיס זגוגי, ויטהליבה reous, ואת קליפת זגוגי היו 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. ג'ל אלקטרופורזה בוצע ב kV 200 במשך 45 דקות, מוכתם פלמינגו (Bio-Rad), ו דמיינו באמצעות הדמיה VersaDoc המערכת (Bio-Rad). פרופילים של רקמות שונות להראות כמה להקות דומות, המציין או משומר או לחצות מזהם חלבונים, כמו גם להקות ייחודי (כוכבית), המעיד על חלבונים מקומי דיפרנציאלי.
Discussion
הגוף הזגוגי הוא ג'ל שקוף למחצה, אשר ההרכב המולקולרי הוא הבין היטב, במיוחד ברמה של substructures שלה: הבסיס זגוגי, הליבה, קליפה, ו hyaloid הקדמי. ליבת זגוגי מכיל collagens השנייה, החמישי, התשיעי, XI, יחד עם כונדרואיטין סולפט proteoglycans, proteoglycans heparan סולפט ו hyaluronan. 1,2 סמנים חלבון הליבה זגוגי נקשרו מחלות כגון רטינופתיה סוכרתית. 3-5 איך חלבונים אלה באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בכל substructures, ובמקרים רבים את זהותם חלבון מסוים, אינם ידועים. פרטים אלה עשויים לתת תובנה למקורו של חלבונים הקשורים למחלות vitreoretinal ספציפיים לעזור בעתיד טיפולים היעד. למרות שלאחר אופטימלית מורטם מרווח לנתיחה רקמות טרם נקבע, פירוק חלבונים עלול להשפיע הניסויים במורד הזרם. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה מושפע ב 12 שעות שלאחר המוות בעיניים וכמה פעילות אנזים מסוים עשוי לרדת תוך מספר שעות (תצפית לא פורסם). כל הרקמות במחקר זה נאספו בין 2 ל 8 שעות של מוות ללא שינויים משמעותיים ביטוי חלבון או התאמה analsyis proteomics. חנקן נוזלי מקפיא שיטת שימור נבחר על קיבעון על מנת למנוע שינויים קטנים במבנה החלבון נגרם על ידי מקבע לחצות קישור, אשר הודגמה ברקמות אחרות באמצעות LC-MS/MS. 6 מחקרים proteomic יהיה תלוי ביכולת במדויק לנתח את תאים שונים של הזגוגית, כפי שמודגם בניסוי הווידאו הזאת. יש לנו תוקף את טכניקת הניתוח באמצעות 1-ממדי SDS-PAGE. כאשר התוצאות שלנו מראים, יש ביטוי דיפרנציאלי חלבונים substructures הגוף השונים זגוגי. זיהוי החלבונים האלה יספקו הבנה מפורטת יותר של מידור זגוגי.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המימון ניתן על ידי להילחם עבור Sight. רקמות התקבלו מבנק העין איווה האריות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J.
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
