Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l'analisi proteomica

Sommario

Questo video mostra una tecnica efficace per differenziare e sezionare le varie semitrasparente strutture del corpo vitreo in post mortem occhi.

Abstract

Il vitreo è una otticamente chiaro, matrice di collagene extracellulare che riempie l'interno dell'occhio e sovrappone la retina. ^1,2 interazioni anomale tra sottostrutture vitreo e la retina alla base di diverse patologie vitreo-retinica, tra cui rottura retinica e distacco, pucker maculare, foro maculare, età degenerazione maculare, la trazione vitreomacular, proliferazione vitreoretinica, retinopatia diabetica proliferativa, e vitreoretinopathies ereditato. ^1,2 La composizione molecolare delle sottostrutture vitreo non è noto. Poiché il corpo vitreo è trasparente con limitato accesso chirurgico, è stato difficile studiare le sue sottostrutture a livello molecolare. Abbiamo sviluppato un metodo per separare e conservare questi tessuti per l'analisi proteomica e biochimica. La tecnica di dissezione in questo video sperimentale mostra come isolare base del vitreo, hyaloid anteriore, centrale vitreo, e la corteccia vitreo da occhi umani post-mortem. Monodimensionale SDS-PAGE analisi di ogni componente vitreo ha dimostrato che la nostra tecnica dissezione portato a quattro profili proteici uniche corrispondenti a ciascuna sottostruttura del corpo vitreo umano. Identificazione di proteine ​​differenzialmente compartimenti rivelerà molecole candidate sottostante varie malattie vitreo-retinica.

Protocollo

1. Segmento dissezione anteriore.

1. La cornea viene rimosso facendo prima un'incisione al limbus, in camera anteriore con una lama di 15 ° (Figura 1). Poi una lama ricurva di cornea-sclerale forbici viene inserito nella camera anteriore. Circonferenziale tagli sono fatti a cornea, appena anteriormente al limbus.
2. 0,12 Colibri pinze e forbici Westcott sono usati per tagliare l'iride circonferenza anteriore del corpo ciliare.
3. Il nucleo dell'obiettivo sia stato rimosso con pinza 0,12 Colibri o una lama di 15 ° (supersharp) e la corteccia e la capsula con le pinze.

2. Nucleo aspirazione vitreo.

1. Un 23-gauge a 5-cc siringa è inserita nella metà del vitreo (Figura 1).
2. Circa 1 ml o più di nucleo vitreo è delicatamente aspirato.
3. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido.

3. Anteriore Hyaloid Dissection.

1. Il hyaloid anteriore è visto come un semi-anello trasparente regolando la luce incidente da una luce microscopio collo d'oca. Aspirazione precedente del nucleo vitreo separa il hyaloid anteriore da altre strutture per una più facile identificazione.
2. Il foglio di tessuto elastico viene accuratamente tirato fuori dal corpo ciliare con Colibri o pinze spogliatoio e tagliato con le forbici Vännäs. Questa manovra viene ripetuta.
3. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido.

4. Base Dissection vitreo.

1. Utilizzando 0,12 pinze per stabilizzare l'oculare, forbici Westcott sono usati per "fiore" l'occhio facendo quattro equidistanti antistress tagli dal corpo ciliare verso la testa del nervo ottico.
2. La pars plicata del corpo ciliare (Figura 2) viene rimosso da ciascuno dei quadranti con le forbici Westcott.
3. La base del vitreo viene poi afferrato su entrambi i lati della serrata con una pinza il pars plana e la retina (Figura 2).
4. Trazione continua sulla base del vitreo è applicato con le pinze. Taglio sequenziale con le forbici Westcott estratti di un semi-trasparente tessuto con un aspetto "filo di perle", come viene asportato.
5. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido.

5. Cortex rimozione vitreo.

1. La pars plana è asportato da ciascuno dei quadranti Westcott con le forbici, tagliando il foglio di circa 3 mm posteriormente al serrata (Figura 2).
2. Tra i volantini dei tessuti, la corteccia vitreo è visualizzato come una pellicola semi trasparente.
3. Il film elastico può essere afferrato con pinze 0,12 o detenuti da adesione ad una Weck-Cel spugna chirurgica. La corteccia vitreo è poi tirato via dalla retina e asportato con le forbici Westcott (Figura 1).
4. Il campione è posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. Tutti i campioni sono conservati a -80 ° C fino al momento utilizzato per la sperimentazione.

6. Rappresentante Risultati

Campioni di tessuto possono essere elaborati da una varietà di metodi per esperimenti specifici. Nel nostro caso, i campioni sono stati sottoposti ad analisi delle proteine ​​mediante SDS-PAGE (Figura 3).

Figura 1. Vista in sezione trasversale dell'occhio umano raffigurante sottostrutture diverse del corpo vitreo. Il vitreo più anteriore è un sottile strato di collagene chiamato hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo comprende l'intera regione centrale del corpo vitreo. Questa porzione del vitreo è più acquoso in contrasto con la base del vitreo, che è abbastanza viscoso per essere afferrato con pinze ed è saldamente attaccato al corpo ciliare e la retina sottostante. Che comprende il nucleo vitreo è un guscio molto sottile collagene chiamata corteccia vitreo.

Figura 2. Anatomia base del vitreo. La base del vitreo è un semi-trasparente sottostruttura del corpo vitreo situato lungo la serrata (frecce bianche), che è la linea di demarcazione che separa il corpo ciliare e la retina. Il margine anteriore della base del vitreo si estende su la pars plana (linea bianca) del corpo ciliare. Il bordo posteriore della base del vitreo si estende 2-3-mm posteriormente al serrata (trattino bianco). Per accise base del vitreo, pinze sono utilizzati per afferrare il tessuto e tirarlo via dal corpo ciliare e la retina sottostante. Una volta elevato, forbici Westcott sono usati per tagliare lungo la base.

Figura 3. Monodimensionale SDS-PAGE di elementi del corpo vitreo. Concentrazioni di proteine ​​totali del hyaloid anteriore, base del vitreo, vitnucleo reous, e la corteccia vitreo sono stati 11,24, 20.1, 16,61, 14,24 mg / ml, rispettivamente. Elettroforesi su gel è stata effettuata a 200 kV per 45 minuti, colorati con Flamingo (Bio-Rad), e visualizzati utilizzando un sistema VersaDoc Imaging (Bio-Rad). I profili per i diversi tessuti mostrano diversi gruppi simili, indicando sia conservata o cross-contaminazione delle proteine, così come unica band (asterisco), indicando proteine ​​differenzialmente localizzate.

Discussione

Il corpo vitreo è un gel semitrasparente cui composizione molecolare è poco conosciuta, soprattutto a livello delle sue sottostrutture: la base del vitreo, core, corteccia, e hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo contiene collagene II, V, IX e XI, insieme con proteoglicani condroitin solfato, solfato di eparan proteoglicani e acido ialuronico. ^1,2 biomarcatori proteine ​​nel nucleo vitreo sono stati associati a malattie come la retinopatia diabetica. ^3-5 Come queste proteine ​​sono differenzialmente espressi in ciascuna delle sottostrutture, e in molti casi l'identità specifica proteina, non sono noti. Questi dettagli può dare qualche idea per l'origine delle proteine ​​associate a specifiche patologie vitreo-retinica e contribuire a future terapie target. Nonostante l'ottimo intervallo post mortem per la dissezione dei tessuti non è stata determinata, la degradazione delle proteine ​​possono influenzare gli esperimenti a valle. Per esempio, l'immunoistochimica è influenzato in 12 ore gli occhi post mortem ed alcune specifiche attività enzimatiche può essere ridotta entro poche ore (osservazione inedita). Tutti i tessuti in questo studio sono stati raccolti tra 2 e 8 ore di morte senza significativi cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​o idoneità per analsyis proteomica. Il metodo di congelamento azoto liquido di conservazione viene scelto più di fissaggio per evitare piccoli cambiamenti nella struttura delle proteine ​​causata da fissativo reticolazione, che è stato dimostrato in altri tessuti da LC-MS/MS. ⁶ studi di proteomica dipenderà dalla capacità di precisione sezionare i diversi compartimenti del vitreo, come dimostrato in questo esperimento video. Abbiamo convalidato la tecnica di dissezione con 1-dimensionale SDS-PAGE. Come i nostri risultati suggeriscono, ci sono proteine ​​differenzialmente espressi nelle diverse sottostrutture corpo vitreo. Identificare queste proteine ​​fornirà una comprensione più dettagliata di compartimentazione vitreo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome	Azienda	Numero di catalogo
0,12 forcipe	Storz oftalmica	E1502
5-cc siringa	Becton Dickinson-	309603
Pinza diritta spogliatoio con dentellature	Storz oftalmica	E1400
23 gauge	Becton Dickinson-	305145
Colibri forcipe	Storz oftalmica	2 / 132
Castroviejo forbici angolata corneale	Storz oftalmica	E3223
Vännäs Forbici capsulotomia curvo	Storz oftalmica	E3387
Weck-Cel chirurgico lance	Medtronic	0008680
Forbici Tenotomia Westcott curvo	Storz oftalmica	E3320