Valutazione dell'inibizione della diffusione virale tramite il silenziamento genomico mediato da mimic di microRNA

Abstract

Fonte: Ruiz, A. J. e Russell, S. J. Regolazione basata sui microRNA del tropismo del Picornavirus. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video illustra l'uso di mimici sintetici di microRNA per inibire selettivamente la replicazione virale in cellule epiteliali coltivate. Mette in evidenza come il silenziamento del genoma indotto dai microRNA possa bloccare la diffusione del virus e confermare la specificità dell'interazione bersaglio-microRNA mediante analisi della infettività a valle.

Protocollo

1. Valutazione della specificità dell'indirizzamento del microRNA: saggio di diffusione virale mediante l'uso di mimici sintetici di microRNA

NOTA: L'uso di un mimico sintetico di microRNA viene effettuato per dimostrare la specificità dell'interazione microRNA:bersaglio del microRNA.

1. Includere controlli di trasfezione mock, controlli con microRNA mimic negativo e controlli con solo microRNA mimic sperimentale in ogni saggio per valutare la tossicità mediata dagli microRNA. È inoltre consigliabile includere un controllo positivo (ad esempio, un gene o un genoma bersaglio dell' microRNA) poiché una bassa efficienza di trasfezione dei microRNA mimic può portare a falsi negativi.
2. Piastrare cellule H1-HeLa in una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti in modo che raggiungano una confluenza dell'80-90% al momento della trasfezione (24 h dopo la semina). Piastrare le cellule in DMEM (mezzo di Dulbecco modificato) supplementato con siero fetale bovino al 10%, aggiungendo 0,1 mL per pozzetto.
   NOTA: Eseguire questo saggio in cellule permissive per la replicazione virale che non esprimono gli microRNA corrispondenti.
3. Portare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente. Combinare 9 µL di mezzo senza siero, 200 nM di concentrazione finale per pozzetto di stock di microRNA mimic, 0,18 µL di reagente booster, 0,18 µL di reagente di trasfezione e mescolare. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 2-5 minuti.
   NOTA: I volumi indicati si riferiscono a ciascun pozzetto. Si raccomanda di preparare una miscela master per la trasfezione di tutti i pozzetti al fine di mantenere la coerenza e ridurre al minimo gli errori di pipettaggio. La concentrazione ottimale del microRNA mimic può variare. Consultare le istruzioni del produttore fornite insieme al microRNA mimic per una concentrazione iniziale ragionevole. Tale concentrazione generalmente varia tra 5 e 200 nM.
4. Aspirare il mezzo dai pozzetti e aggiungere 92 µL di mezzo completo fresco.
   NOTA: Se il numero di campioni è elevato, eseguire questo passaggio prima di preparare la soluzione di trasfezione e conservare la piastra a 37 °C fino al momento dell'uso.
5. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione alle cellule goccia a goccia.
6. Incubare a 37 °C per 6 h.
7. Infettare ciascun pozzetto a un basso MOI (molteplicità di infezione) per garantire che una bassa percentuale di cellule venga infettata, consentendo l'analisi della diffusione del virus. Questo protocollo utilizza un MOI di 0,2.
   1. Diluire le scorte virali in mezzo senza siero fino a una concentrazione di MOI = 0,2 ogni 100 µL. Rimuovere il mezzo dai pozzetti e aggiungere 100 µL di diluizione virale per pozzetto.
   2. Incubare a 37 °C per 2 h.
8. Aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 100 µL di mezzo completo fresco.
9. Incubare a 37 °C per 20-22 h.
10. Determinare la titolazione del virus nei supernatanti.
    1. Raccogliere il supernatante da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 µL di mezzo completo fresco.
       NOTA: Se si utilizzano cellule in sospensione, risospendere il pellet cellulare ottenuto nel passaggio successivo in 100 µL di mezzo completo fresco e reinserire nel pozzetto del campione per il saggio di vitalità.
    2. Rimuovere i detriti cellulari dai supernatanti raccolti centrifugando a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Trasferire il supernatante chiarificato in un tubo nuovo e titolare il virus infettivo su cellule permissive che non esprimono gli microRNA corrispondenti. 
       NOTA: Mantenere tutti i campioni sul ghiaccio per prevenire la perdita di infettività.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua priva di nucleasi	Fisher Scientific	AM9938
Reagente di trasfezione TransIT-2020	Mirus	MIR 5404
Reagente di trasfezione TransIT-mRNA	Mirus	MIR 2225
Tubi con tappo a vite da 2 mL	Sarstedt	72.694.005
Mimetici di microRNA	Dharmacon	Varied
Saggio di proliferazione cellulare MTT	ATCC	30-1010K