Generazione di un virus del morbillo ricombinante codificante per una proteina immunostimolante

Abstract

Fonte: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxovirus per l'Immunomodulazione Mirata ai Tumori: Progettazione e Valutazione Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video viene illustrata la generazione di virus del morbillo ricombinanti mediante l'utilizzo di liposomi per veicolare plasmidi che codificano l'antigenoma virale e le proteine ausiliarie essenziali all'interno di cellule produttrici. L'RNA trascritto e replicato porta alla formazione di particelle virali che esprimono proteine reporter immunostimolanti e fluorescenti. Successivamente, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare la formazione di sincizi, confermando la corretta produzione del virus ricombinante.

Protocollo

NOTA: [O], [P] e [M] indicano sottosezioni applicabili rispettivamente a: virus oncolitici (VO) in generale, (molti) paramixovirus o solo al virus del morbillo (MV). [B] indica sezioni specifiche per transgeni di leganti biespecifici per linfociti T (BTE).

1 Clonaggio di transgeni codificanti immunomodulatori in vettori del virus del morbillo

1. [O] Progettare la sequenza dell'inserto.
   1. [O] Scegliere un immunomodulatore di interesse sulla base di ricerche letterarie o di dati esplorativi come schermate genetiche e ricavare la sequenza di DNA complementare (cDNA) pertinente da database appropriati come GenBank, l'Archivio Europeo dei Nucleotidi o il sistema internazionale di informazioni ImMunoGeneTics (IMGT).
   2. [O] Aggiungere caratteristiche aggiuntive alla sequenza del transgene (Figura 1). Una sequenza Kozak precedente e un'ottimizzazione dei codoni specifica per la specie possono migliorare l'espressione. Sono necessarie sequenze segnale per la secrezione. Includere sequenze che codificano marcatori proteici N- e/o C-terminali per rilevamento e purificazione. Includere siti di restrizione per l'inserzione nel vettore.
      NOTA: [M] Sono necessarie unità aggiuntive di trascrizione (ATU) contenenti i segnali di inizio e fine del gene della polimerasi del MV per l'espressione del transgene da genomi ricombinanti di MV. Vettori cDNA anti-genomici adatti, controllati da promotori del citomegalovirus (CMV) e contenenti ATU con siti di restrizione unici per l'introduzione di transgeni a senso positivo in posizioni definite, sono stati sviluppati in precedenza. [P] La posizione adeguata del transgene è cruciale, poiché influisce sulla replicazione virale e sull'espressione del transgene a causa del gradiente di espressione tipico dei paramixovirus. L'inserimento in un'ATU vicina all'estremità 3' dell'anti-genoma (cioè nella posizione leader o a valle del gene P) generalmente determina un'elevata espressione del transgene a scapito di una replicazione virale ridotta. Una replicazione aumentata e livelli più bassi di espressione del transgene possono essere attesi utilizzando l'ATU a valle del gene H. L'incapsidamento del genoma di diversi paramixovirus, incluso il virus del morbillo, richiede il legame di sei nucleotidi da parte di ogni proteina del nucleocapside. Per l'inserzione di transgeni in tali virus, assicurarsi che il numero di nucleotidi dell'intero genoma sia divisibile per sei. Questo è noto anche come "regola del sei". Se necessario, includere nucleotidi aggiuntivi nell'inserto (a monte della sequenza Kozak o a valle del codone di stop) senza introdurre slittamenti della cornice di lettura o codoni di stop prematuri. [M] Evitare sequenze particolari nel transgene simili ai segnali di inizio (AGGRNCMARGW) e di fine (RTTAWANAAAA) del gene del MV e alle sequenze di editing dell'RNA (AAAAAGGG).
   3. [O] Acquistare oligonucleotidi della sequenza desiderata o assemblarli da sequenze disponibili utilizzando tecniche standard di clonaggio molecolare.
      NOTA: [O] Per l'amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) del transgene, progettare un primer diretto contenente il sito di restrizione a monte e i primi 15-20 nucleotidi dell'inserto e un primer inverso contenente gli ultimi 15-20 nucleotidi dell'inserto seguiti dal sito di restrizione a valle.
2. [O] Clonare l'inserto nel DNA che codifica il genoma (anti-genoma) virale.
   1. [O] Clonare l'inserto in vettori di DNA o anti-genomi di virus a RNA mediante tecniche standard di clonaggio molecolare (cioè restrizione enzimatica seguita da ligazione del DNA).
      1. [O] Prevenire la re-ligazione del vettore utilizzando siti di restrizione non compatibili o de-fosforilazione prima della ligazione.
      2. [O] Isolare il prodotto della ligazione mediante elettroforesi su gel di agarosio e successiva purificazione del gel utilizzando kit disponibili in commercio. In generale, l'efficienza ottimale di ligazione si ottiene con un rapporto molare di 3:1 tra inserto e vettore.
   2. [O] Trasformare il prodotto della ligazione in batteri competenti adatti al recupero efficiente di plasmidi di grandi dimensioni (cioè eseguire uno shock termico di E. coli) e identificare le colonie batteriche contenenti il DNA corretto mediante PCR su colonie.
   3. [O] Isolare il DNA amplificato da una singola colonia batterica utilizzando kit di preparazione del DNA disponibili in commercio. Confermare l'integrità genomica mediante digestione di controllo con enzimi di restrizione appropriati (ad es., HindIII per genomi MV [M]). Confermare l'inserzione corretta e l'integrità del transgene mediante sequenziamento.
      NOTA: [M] Per transgeni inseriti nell'ATU H del MV, eseguire il sequenziamento di Sanger con i seguenti primer: H-9018 [primer diretto, si lega alla posizione 9018 del genoma MV nell'ORF H (open reading frame)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (primer inverso, si lega alla posizione 9249 del genoma MV nell'ORF L): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. Recupero di particelle virali ricombinanti del morbillivirus che codificano per immunomodulatori

1. [O] Generare particelle virali ricombinanti a partire da DNA (anti-)genomico mediante trasfezione di cellule produttrici di virus seguendo il protocollo standard per il rispettivo virus. Seguire le linee guida per il lavoro in condizioni sterili. Eseguire la coltura cellulare sotto cappe, in particolare tutti i passaggi che coinvolgono il virus, in armadietti di sicurezza biologica di classe II.
   1. [M] Per il recupero di virus del morbillo da cDNA, seminare cellule produttrici di MV (cellule Vero derivate da rene di scimmia verde africana) in modo uniforme in una piastra a 6 pozzetti 24 h prima della trasfezione. Seminare 2 x 10⁵ cellule in 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) per pozzetto, al fine di ottenere una confluenza del 65–75% al momento della trasfezione.
      NOTA: [P] Ridurre il numero di cellule se queste superano la confluenza prima della formazione di sincizi indotta dal virus.
   2. [P] Trasfettare le cellule con DNA che codifica l'anti-genoma virale, plasmidi ausiliari richiesti e, se desiderato, un plasmide che codifica un marcatore fluorescente per valutare l'efficienza di trasfezione.
      1. [M] Mescolare 5 µg di DNA ricombinante che codifica l'anti-genoma del virus del morbillo, 500 ng ciascuno di plasmidi di espressione mammiferi che codificano le proteine N e L del virus del morbillo e 100 ng ciascuno di plasmidi che codificano la proteina P, in un volume totale di 200 µL di DMEM. Se necessario per valutare l'efficienza di trasfezione (e se non già presente all'interno della costruzione dell'anti-genoma virale), aggiungere 100 ng di un plasmide marcatore fluorescente.
      2. Aggiungere 18,6 µL di reagente di trasfezione liposomiale, mescolare immediatamente agitando delicatamente il tubo e incubare per 25 min a temperatura ambiente (RT).
      3. [P] Sostituire il mezzo con 1,8 mL di DMEM, 2% FBS, 50 µg/mL di kanamicina (o altri antibiotici per prevenire contaminazioni) per pozzetto, quindi aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia nel pozzetto e agitare delicatamente. Incubare le cellule tutta la notte a 37 °C, 5% CO₂. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con 2 mL di DMEM fresco, 2% FBS e 50 µg/mL di kanamicina; ripetere l'operazione quando il mezzo diventa acido.
         ATTENZIONE: [O] Manipolare cellule e materiali secondo le normative di sicurezza biologica, poiché il virus potrebbe essere presente dalla trasfezione attraverso i passaggi successivi. Smaltire adeguatamente i rifiuti (potenzialmente) infettivi.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica del genoma di un virus del morbillo. La proteina verde fluorescente migliorata (eGFP) è codificata in un'unità di trascrizione aggiuntiva a valle della sequenza leader (ld). N, P, M, F, H e L indicano i geni che codificano rispettivamente le proteine strutturali del virus del morbillo: nucleoproteina, proteina P, proteina matrice, proteina fusogena, emagglutinina e proteina grande (polimerasi), espressi in modo differenziale come mostrato sopra. Un transgene codificante un agente bifunzionale per linfociti T (BTE) è inserito in un'unità di trascrizione aggiuntiva (ATU) a valle del frame di lettura aperto H. Il transgene codifica un peptide segnale della immunoglobulina kappa (Igκ) per una secrezione efficiente, nonché i marcatori proteici emagglutinina influenzale (HA) ed esa-istidina (His) per la rilevazione e la purificazione. I geni che codificano i domini variabili della catena pesante (VH) e della catena leggera (VL) di anticorpi diretti contro CD3 e CD20, rispettivamente, sono collegati tramite sequenze di linker peptidici contenenti residui di glicina (G) e serina (S). La sequenza del transgene è preceduta da una sequenza di Kozak. A valle della regione codificante, sono stati inclusi ulteriori nucleotidi come esempio per rispettare la regola del sei. La cassetta di inserzione è delimitata da due siti di restrizione che ne permettono l'inserimento nell'ATU corrispondente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Rapido per Dephos e Ligazione del DNA	Roche Life Science, Mannheim, Germania	4898117001
Kit CloneJET per Clonaggio PCR	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
Agarosio	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania	A9539-500G
Kit QIAquick per Estrazione da Gel	QIAGEN, Hilden, Germania	28704
E. coli Competente NEB 10-beta	New England Biolabs (NEB), Francoforte sul Meno, Germania	C3019I
Kit QIAquick per Miniprep	QIAGEN, Hilden, Germania	27104
Enzima di restrizione HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Francoforte sul Meno, Germania	R3104S
Mezzo Dulbecco Modificato di Eagle (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germania	31966-021
Siero bovino fetale (FBS)	Biosera, Boussens, Francia	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Germania	E2311	può essere sostituito da un reagente di trasfezione a scelta
Kanamicina	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania	K0129
Cellule Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
Piastre a 6 pozzetti	Neolab, Heidelberg, Germania	353046