Produzione e raccolta di cellule epiteliali terapeutiche produttrici di virus

Abstract

Fonte: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxovirus per l'Immunomodulazione Mirata ai Tumori: Progettazione e Valutazione Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video illustra il processo di infezione di cellule epiteliali renali con virus ingegnerizzati geneticamente per la loro produzione e raccolta allo scopo di studiare la replicazione virale.

Protocollo

1. Determinazione delle capacità replicative e citotossiche di vettori virali che codificano per immunomodulatori

Confronta la cinetica di replicazione del virus ricombinante generato e del vettore non modificato mediante curve di crescita ad un solo passaggio o a più passaggi (GC). Nelle GC ad un solo passaggio, la progenie virale viene valutata dopo l'infezione simultanea di tutte le cellule (teoricamente, infezione al 100%). Le GC a più passaggi iniziano con una bassa percentuale di cellule infette per seguire diversi cicli di replicazione virale.

1. Per l'analisi della cinetica di replicazione del virus del morbillo, seminare 1 x 10⁵ cellule Vero in 1 mL di DMEM (mezzo di Eagle modificato di Dulbecco) con 10% di FBS (siero bovino fetale) per pozzetto in piastre a 12 pozzetti un giorno prima dell'infezione. Piastrare almeno due pozzetti per ciascun punto temporale di interesse come repliche tecniche.
2. Infectare le cellule con il virus a un basso MOI (molteplicità di infezione) per le curve di crescita multistep o a un alto MOI per le curve di crescita unistep (0,03 e 3 per MV o virus del morbillo) sulla replicazione delle cellule Vero, rispettivamente. Sostituire il mezzo con 300 µL di mezzo senza siero contenente la quantità corrispondente di virus e incubare a 37 °C e 5% CO₂ per almeno 2 h. Rimuovere l'inoculo, aggiungere 1 mL di DMEM con 10% di FBS e proseguire l'incubazione.
3. Nei punti temporali rilevanti, come 12, 24, 36, 48, 72 e 96 h dopo l'infezione, raccogliere la progenie virale raschiando direttamente le cellule nel mezzo. Trasferire il contenuto di ogni pozzetto in un tubo individuale, congelare rapidamente in azoto liquido e conservare a -80 °C fino alla titolazione.
   NOTA: I campioni replicati possono essere raggruppati in questo passaggio per l'analisi dei titoli medi.
4. Raccogliere i campioni da tutti i punti temporali. Scongelarli contemporaneamente a 37 °C per la valutazione della progenie virale. Vortexare e pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione per 5 min a 2.500 x g e 4 °C.
5. Calcolare i titoli medi di ciascun costrutto e punto temporale come descritto in precedenza. Riportare i titoli in funzione del tempo. Confrontare le curve di crescita dei vettori con e senza transgeni inseriti, con diversi transgeni o con transgeni inseriti in posizioni diverse (vedere Figura 1).

Risultati

Figura 1: Cinetiche di replicazione e attività litica di virus del morbillo ricombinanti. (A) Le curve di crescita in un unico passaggio sono state ottenute dopo infezione di cellule Vero con il virus del morbillo oncolitico non modificato (MV) o con il virus del morbillo che codifica un innesco biespecifico per linfociti T (MV-H-mCD3xhCD20) a un MOI di 1. I titoli della progenie virale sono stati valutati ai tempi prestabiliti dopo l'infezione, indicando cinetiche di replicazione virale simili. Sono mostrate la media e la deviazione standard di otto campioni (quattro replicati tecnici ciascuno di due replicati biologici per ogni punto temporale). (B) La vitalità cellulare è stata valutata su cellule di carcinoma colorettale murino MC38 che esprimono stabilmente l'antigene carcinoembrionario umano e il recettore del virus del morbillo CD46 (MC38-CEA-CD46) dopo inoculazione con mezzo di coltura esclusivamente (mock) o con i virus indicati a un MOI di 1. Il saggio di vitalità cellulare XTT è stato eseguito ai tempi indicati. Una riduzione della vitalità cellulare è stata osservata in tempi precoci per il vettore non modificato. Valori superiori al 100%, calcolati per MV-H-mCD3xhCD20 al tempo di 12 h, sono spesso osservati poco dopo l'infezione, probabilmente a causa di stress cellulare o di fattori derivati dalle cellule presenti nella sospensione virale. Sono mostrati i valori medi più la deviazione standard di tre replicati tecnici per ciascun punto temporale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo di Eagle Modificato di Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germania	31966-021	Utilizzato per la semina e l'infezione delle cellule Vero
Serum Fetale Bovino (FBS)	Biosera, Boussens, Francia	FB-1280/500	Per la supplementazione del DMEM
Cellule Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	Cellule ospiti per la propagazione e i saggi del virus del morbillo
Piastre a 12 pozzetti	Neolab, Heidelberg, Germania	353043	Per la semina delle cellule Vero (1 × 10⁵ per pozzetto)
Opti-MEM (mezzo senza siero)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germania	31985070	Per il passaggio di infezione virale (incubazione senza siero)
Soluzione Salina Fosfato-Tampone (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germania	14190-094	Per il lavaggio e la preparazione del mezzo
Lifter cellulare	Corning, Reynosa, Messico	3008	Utilizzato per raschiare le cellule infette al momento del raccolto
Provette da 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germania	02-572-3001	Per la raccolta dei campioni e la centrifugazione
Azoto liquido	—	—	Per il congelamento rapido dei campioni virali raccolti
Centrifuga (capace di 2.500 × g)	—	—	Per la formazione del pellet dei detriti cellulari
Kit di Viabilità Cellulare XTT (Kit Colorimetrico di Viabilità Cellulare III)	PromoKine, Heidelberg, Germania	PK-CA20-300-1000	Include il reagente XTT; per la misurazione della citotossicità
Piastre a 96 pozzetti, fondo piatto	Neolab, Heidelberg, Germania	353072	Per la misurazione dell'assorbanza a 450 nm
Spettrofotometro / Lettore di micropiastre	—	—	Per misurare l'assorbanza ottica a 450 nm (riferimento 630 nm)
Incubatore a anidride carbonica	—	—	37 °C, 5% CO₂ per tutte le incubazioni cellulari