Valutare la funzionalità immunologica degli immunomodulatori isolati. Di seguito viene descritto in dettaglio come valutare la citotossicità mediata da cellule indotta da un agente bifunzionale per linfociti T (BTE) mediante saggio di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH). Stabilire le condizioni da testare durante l'esperimento (si veda la Figura 1 come esempio). È possibile variare i tempi di incubazione (da ore a giorni), le concentrazioni dell'immunomodulatore (da pg/mL a µg/mL) e i rapporti effettore:bersaglio (E:T) (ad esempio tra 1:50 e 50:1). Preparare sempre i campioni in triplicato. Includere campioni senza proteina BTE e senza cellule effettrici, controlli per il rilascio spontaneo di LDH delle singole popolazioni cellulari (Tsp ed Esp), un controllo di lisi massima delle cellule bersaglio (Tmax) con aggiunta di detergente prima della lettura, un controllo con solo mezzo e un controllo volumetrico per Tmax. NOTA: Il numero richiesto di cellule bersaglio e i tempi di incubazione possono variare. Eseguire prove preliminari senza cellule effettrici e immunomodulatori per identificare i parametri ottimali. Includere campioni Tsp e Tmax e i relativi controlli per valutare diversi numeri cellulari e tempi di incubazione. Isolare le cellule effettrici immunitarie (ad esempio mediante centrifugazione su gradiente di densità del sangue umano per ottenere cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o selezione negativa di linfociti T murini da splenociti di topo). Semina le cellule bersaglio (ad esempio 5 x 10³ per pozzetto) in una piastra 96 pozzetti a fondo rotondo. Aggiungere la proteina isolata alle concentrazioni desiderate nei rispettivi campioni. Aggiungere le cellule effettrici immunitarie nei rapporti desiderati. Aggiungere mezzo fino a un volume totale di 100 µL per pozzetto. Incubare per il periodo di tempo stabilito, tipicamente tra 4 e 48 h (24 h per PBMC non stimolati e 48 h per linfociti T murini appena isolati; tempi di incubazione più brevi possono essere utilizzati per cellule immunitarie pre-stimolate), a 37 °C e 5% CO₂. 45 minuti prima della raccolta dei campioni, aggiungere 10 µL di soluzione di lisi 10x nei pozzetti contenenti i campioni Tmax e i corrispondenti controlli con mezzo. Continuare l'incubazione. Centrifugare le cellule a 250 x g per 4 min. Trasferire 50 µL di ciascun sopranatante in una piastra 96 pozzetti a fondo piatto. Evitare di trasferire le cellule per prevenire il rilascio di LDH legata alle cellule. Preparare la soluzione substrato seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 50 µL a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente [RT] al buio per 30 min o fino a quando i campioni Tmax assumono un colore rosso scuro. Aggiungere 50 µL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Rimuovere le bolle d'aria mediante centrifugazione per 1 min a 4.000 x g e manualmente con un ago cavo. Misurare l'assorbanza ottica a 490 nm. Calcolare i valori di lisi specifica percentuale per ciascun campione. Calcolare le medie dei replicati dei controlli con mezzo, con e senza soluzione di lisi. Sottrarre i valori ottenuti dai campioni sperimentali e dai controlli di lisi massima e di rilascio spontaneo, rispettivamente. Utilizzare questi valori corretti per il fondo per i calcoli successivi. Calcolare le medie dei controlli Tmax, Tsp ed Esp corretti per il fondo. Utilizzando questi valori medi, la seguente equazione fornisce la percentuale di lisi specifica per ciascun campione: Rappresentare graficamente i valori di lisi specifica percentuale in funzione della concentrazione della proteina o del rapporto E:T e confrontarli con i campioni di controllo non diretti al bersaglio. Heidbuechel, J. P., et al.. Paramyxovirus per l'immunomodulazione mirata ai tumori: progettazione e valutazione ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).
Questo video dimostra un saggio cellulare per valutare l'attività immunomodulatrice specifica per il bersaglio di un engager bispecifico per linfociti T (BTE) codificato da un virus. Il BTE collega le cellule tumorali che esprimono un recettore bersaglio ai linfociti T, innescando la lisi tumorale e il rilascio di enzimi. Un lettore colorimetrico, basato sulla conversione del substrato, indica l'attivazione dei linfociti T. Un'intensità di colore maggiore nel campione in esame conferma l'interazione immunitaria mediata dal BTE e specifica per il recettore.
