Recupero di virioni infettivi da cellule trasfettate con RNA sintetico derivato da cromosoma artificiale batterico

Abstract

Fonte: Yun, S. et al. Cromosomi Artificiali Batterici: Uno Strumento di Genomica Funzionale per lo Studio dei Virus a RNA a Filamento Positivo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra il recupero del virus dell'encefalite giapponese infettivo da un RNA sintetico trascritto da un clone di cromosoma artificiale batterico. Illustra come le cellule vengano elettroporate con l'RNA sintetico, consentendo al genoma virale di dirigere la produzione di nuove virioni. Le placche risultanti formate nei monolayer cellulari infetti confermano il successo nel recupero del virus infettivo.

Protocollo

1. Determinare l'infettività dell'RNA e la resa virale

1. Coltivare cellule di rene di criceto baby-21 (BHK-21) in piastre da coltura da 150 mm a una densità di 3 × 10⁶ cellule/piatto per 24 ore a 37 °C con 5% di CO₂.
   NOTA: Mantenere le cellule BHK-21 in mezzo minimo essenziale alfa integrato con 10% di siero fetale bovino, 2 mM di glutammina, vitamine e penicillina/streptomicina.
2. Risciacquare il monostrato cellulare con 10 ml di Soluzione A fredda (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ e 1,5 mM KH₂PO₄). Staccare le cellule dalle piastre trattandole con 4 ml di tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,25%) e raccoglierle mediante centrifugazione a 270 × g in una centrifuga da banco per 2 minuti.
3. Risospendere il pellet cellulare con 50 ml di Soluzione A fredda in un tubo conico da 50 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 270 × g per 2 minuti. Ripetere questa procedura di lavaggio tre volte; dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet cellulare a una densità di 2 × 10⁷ cellule/ml in Soluzione A.
4. Mescolare un'aliquota di 400 µl di sospensione cellulare con 2 µg di RNA sintetico in una cuvetta con interstizio da 2 mm ed eseguire immediatamente l'elettroporazione della miscela con un elettroporatore alle condizioni ottimali: 980 V, durata dell'impulso di 99 µsec e 5 impulsi (Figura 1C).
5. Lasciare le cellule elettroporate a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti e trasferirle in un microtubo da 1,7 ml contenente 600 µl di mezzo di coltura completo.
6. Preparare una diluizione seriale decimale delle cellule elettroporate in 1 ml di mezzo di coltura completo e seminare un’aliquota di 100 µl di ciascuna diluizione sui monostrati di cellule BHK-21 non elettroporate (5 × 10⁵) in una piastra a 6 pozzetti.
7. Dopo un'incubazione di 4-6 ore, ricoprire le cellule con agarosio allo 0,5% in mezzo essenziale minimo contenente il 10% di siero fetale bovino. Incubare le piastre per 4 giorni a 37 °C con 5% di CO₂.
8. Visualizzare i centri infettivi (placche) mediante fissazione con formaldeide al 7% e colorazione con violetto di metile all'1% in etanolo al 5% (Figura 2A).
   1. Facoltativo: esaminare le cellule elettroporate con RNA a 18-20 ore dal transfezionamento per l'espressione proteica del virus dell'encefalite giapponese (JEV) mediante saggio di immunofluorescenza (Figura 2B) e raccogliere i soprannatanti dalle cellule elettroporate con RNA a 22 e 40 ore dal transfezionamento per la titolazione virale mediante saggio delle placche (Figura 2C).

Risultati

Figura 1. Panoramica sul recupero di virus infettivi da un DNA complementare (cDNA) completo di JEV SA₁₄-14-2 assemblato in un cromosoma artificiale batterico (BAC). (A) Linearizzazione del template di cDNA. Il BAC completo di JEV viene tagliato con XbaI e trattato con nucleasi di mung bean (MBN). (B) Sintesi dei trascritti di RNA. Il cDNA linearizzato viene trascritto dalla polimerasi SP6 per l'RNA in presenza dell'analogon di cap m⁷G(5')ppp(5')A. (C) Recupero dei virus sintetici di JEV. Gli RNA trascritti in vitro vengono trasfettati in cellule BHK-21 mediante elettroporazione, generando un alto titolo di virus sintetico.

Figura 2. Infettività specifica degli RNA sintetici trascritti da un BAC completo di JEV e recupero del virus sintetico. Le cellule BHK-21 vengono elettroporate con un controllo fittizio (Mock) o con i trascritti di RNA derivati da ciascuna delle due copie indipendenti del BAC completo di JEV (Cl.1 e Cl.2). (A) Infettività dell'RNA. Le cellule vengono ricoperte con agarosio e colorate con violetto cristallo a 4 giorni dal transfezionamento. L'infettività dell'RNA viene determinata mediante saggi di centri infettivi per stimare la quantità di RNA infettivo elettroporato nelle cellule (pannello sinistro). Vengono inoltre mostrate immagini rappresentative dei centri infettivi (pannello destro). (B) Espressione proteica. Le cellule vengono coltivate in camere da coltura a 4 pozzetti. L'espressione delle proteine virali nelle cellule elettroporate con RNA a 20 ore dal transfezionamento (hpt) viene analizzata mediante saggi di immunofluorescenza utilizzando un siero primario di coniglio anti-proteina non strutturale 1 (NS1) e un anticorpo secondario di capra anti-immunoglobulina G (IgG) coniugato con Cy3 (rosso). I nuclei vengono contrastati con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (blu). Le immagini di immunofluorescenza vengono sovrapposte alle corrispondenti immagini di contrasto a interferenza differenziale. (C) Resa virale. Le cellule vengono coltivate in piastre da coltura da 150 mm. La produzione di virioni infettivi accumulati nei supernatanti di coltura delle cellule elettroporate con RNA a 22 e 40 ore dal transfezionamento (hpt) viene valutata mediante saggi di formazione di placche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo Minimo Essenziale Alfa	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarosio	Lonza	50004
Tubo Conico (50 mL)	VWR	21008-242
Violetto di Cristallo	Sigma-Aldrich	C0775
Piatto di Coltura (150 mm)	TPP	93150
Cuvetta (Interspazio 2 mm)	Harvard Apparatus	450125
Siero Fetale Bovino	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldeide	Sigma-Aldrich	F1635	Tossica e cancerogena
Glutammina	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Mezzo Minimo Essenziale	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicillina/Streptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloruro di Potassio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato Monobasico di Potassio	Sigma-Aldrich	P9791
Piastra a Sei Pozzi	TPP	92006
Cloruro di Sodio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato Dibasico di Sodio	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitamine	Sigma-Aldrich	M6895
Incubatore CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrifuga da Banco	Thermo Scientific	ST16R
Elettroporatore	Harvard Apparatus	ECM 830