Studiare l'integrazione degli adulti nati Neuroni

Sommario

Un modo per studiare l'integrazione del neonato granuli dentato negli animali adulti è descritto. Questa tecnica utilizza un retrovirus progettato per etichettare i neuroni neonati, seguita da registrazioni elettrofisiologiche in vivo per determinare integrazione funzionale.

Abstract

Neurogenesi si verifica nel cervello adulto dei mammiferi nella zona sub-ventricolare (SVZ) del ventricolo laterale e nella zona sub-granulare (SGZ) del giro dentato dell'ippocampo tutta la vita. Rapporti precedenti hanno mostrato che la neurogenesi ippocampale adulta è associata a disturbi cerebrali diverse, quali l'epilessia, la schizofrenia, depressione e ansia (1). Decifrare il processo di normale e aberrante adulti nati integrazione neurone può mettere in luce l'eziologia di queste malattie e informare lo sviluppo di nuove terapie.

Neurogenesi adulta SGZ specchi embrionale e post-natale sviluppo neuronale, comprese le fasi di specificazione destino, migrazione, integrazione sinaptica, e la maturazione. Tuttavia, l'integrazione avviene su un prolungato periodo di 6 settimane. Iniziale di ingresso sinaptico per adulti nati in granuli SGZ dentato (DGCS) è GABAergici, seguita da ingresso glutammatergica a 14 giorni (2). I fattori specifici che regolano la formazione circuito di adulti nati neuroni nel giro dentato sono attualmente sconosciute.

Il nostro laboratorio utilizza una replica con deficit vettore retrovirale basato sul virus della leucemia murina Moloney per fornire proteine ​​fluorescenti e ipotizzato geni regolatori a queste cellule proliferanti. Questa tecnica fornisce virale elevata specificità e la risoluzione per l'analisi di data cellula nascita, lignaggio, morfologia e sinaptogenesi.

Un tipico esperimento utilizza spesso due o tre virus che contiene un'etichetta unica, transgene, promotore e gli elementi per cella singola analisi di un processo di sviluppo desiderato in vivo. Il seguente protocollo descrive un metodo per l'analisi funzionale integrazione neonato utilizzando un unico neurone verde (GFP) o rosso (dTomato) retrovirus proteina fluorescente e patch-clamp elettrofisiologia.

Protocollo

1. Virus iniezione

Alto titolo retrovirus ingegnerizzati (1 × 10 ⁹ unità / ml) è prodotto da co-trasfezione di vettori retrovirali e VSVG in cellule HEK293T, seguita da ultracentrifugazione di supernatante virale. Per le fonti e metodi di produzione, vedere la dimostrazione eccellente Giove (3).

Nota: Giovani adulti (4-6 settimane) femminile C57BL / 6 topi (Charles River) si trovano in condizioni standard. Tutte le procedure seguite la Guida Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso di animali da laboratorio in un protocollo approvato dalla Stony Brook University IACUC.

1. 2ul disgelo dei retrovirus congelati per animale sul ghiaccio.
2. Anestetizzare (100 ketamina xylazina mcg + 10 mcg per grammo di peso corporeo) e montare l'animale su un telaio stereotassico (Steolting). Rimuovere i capelli sulla testa e pulire la pelle con il 70% di etanolo.
3. Esporre il cranio e quattro fori poco profondi con un trapano odontoiatrico (punta 0,6 millimetri) alle seguenti coordinate:
   • anterioposterior = -2 mm dal bregma; laterale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 dal bregma; laterale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
   • anterioposterior = -2 mm dal bregma; laterale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 dal bregma; laterale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
4. Montare un Hamilton 1ml, piatto punta della siringa e iniettare 0,5 microlitri retrovirus per sito ad un tasso di 0,25 microlitri / min nel giro dentato. (Vedi le coordinate sopra per profondità ventrale.) Pausa 2 minuti dopo ogni iniezione prima di ritirarsi lentamente la siringa per evitare il riflusso del fluido. Tra le iniezioni, brevemente risciacquare la superficie esterna della punta della siringa con PBS sterile e un applicatore per eliminare tracce di sangue.
5. Chiudere la ferita con materiale di sutura chirurgico sterile (tipo P-1; Dimensione 6-0) e rispedire l'animale verso condizioni abitative standard fino a quando le fasi di tempo desiderato dopo l'iniezione.

2. Fetta di preparazione

Per ottenere fettine acute di alta qualità da topi adulti, si usa una soluzione di taglio per la preparazione modificato slice (vedi sotto).

1. Pre-chill soluzione di taglio di 0-4 ° C su ghiaccio e bolla con il 95% O ₂ -5% di CO ₂ per almeno 30 minuti.
2. Anestetizzare e transcardially profumato un animale con ghiaccio-freddo di ossigeno soluzione satura di taglio.
3. Rimuovere rapidamente il cervello in una petri-piatto con carta da filtro pre-bagnate con il freddo, la soluzione ossigenata di taglio. Tagliare il cervelletto e tagliare una superficie di montaggio anteriore di almeno 1 mm a il (visibile) coordina iniezione. Incollare il cervello su un palco vibrotome e montarlo nella camera di taglio pieno di freddo e ossigenato soluzione di taglio.
4. Preparare le fette coronali o orizzontale (300-350μm) e trasferirli con un grosso pipetta ad una camera di incubazione contenente temperatura ambiente ACSF bollito con il 95% O ₂ / 5% di CO _2.
5. Incubare le fette, bolle continuamente, a 32 ° C per 30-60 minuti. Ritorna la camera a temperatura ambiente per tutta la durata della registrazione.

3. Esperimenti di elettrofisiologia

1. Fette sono trasferito nella camera di registrazione che viene continuamente perfuso con l'ossigeno-saturi ACSF a 32 ° C - 34 ° C.
2. Un elettrodo di tungsteno bipolare di stimolazione è collocato nello strato molecolare del giro dentato utilizzando un microscopio a bassa obiettivo ingrandimento (10X).
3. DGCS neonato nella sub-zona granulare / strato di cellule granulari sono identificati mediante l'espressione di GFP o dTomato. A cellula intera registrazione patchclamp viene eseguita su neuroni neonati sotto forte ingrandimento (40X).
4. Le proprietà di cottura delle cellule registrate sono ottenute mediante iniezione di una serie di correnti in current-clamp mode.
5. Stimoli elettrici sono forniti da stimolazione l'elettrodo attraverso un isolatore stimolazione controllata dal software di registrazione, e le correnti post-sinaptiche evocate nella DGCS neonati sono registrati.

4. Analisi dei dati

Ampiezze delle risposte evocate postsinaptici sono analizzate a differenti stadi di sviluppo degli adulti nati neuroni.

5. Rappresentante Risultati

Utilizzando il protocollo di cui sopra, l'espressione della GFP in neuroni neonati giro dentato simile alla figura 1 è comune. Si noti che i neuroni neonati sono facilmente visibili ed entrambi i dendriti e degli assoni sono robustamente etichettati. Espressione in sottili assoni DGC e piccole spine dipende dalla qualità e titolo del virus, il promotore utilizzato e la lunghezza di espressione in vivo. Nelle nostre mani, le cellule neonato e sub-organelli cellulari sono di solito visibili in pochi giorni dopo l'iniezione, e l'espressione della colonna vertebrale possono essere rintracciate fin dai primi stadi dello sviluppo. Wbuco celle registrazioni da neuroni neonati in fasi di tempo diversi permettono lo studio delle uniche proprietà delle celle neonato, potenziali d'azione ad esempio (Figura 2a), così come il processo di integrazione sinaptica esistente in circuiti neurali durante la maturazione (Figura 2b).

Figura 1 2-fotone immagine confocale dei neuroni neonati in una sezione orizzontale giro dentato di un topo adulto. Le cellule verdi sono 21dpi (giorni dopo l'iniezione) GFP che esprimono DGCS neonato etichettato con pUX-GFP retrovirus.

Figura 2 a) Azione potenziale cottura proprietà di un neonato DGC a 21 dpi. B) rappresentante evocato eccitatorio correnti post-sinaptiche (EPSCs) registrati su un DGC neonato a 21 dpi.

Discussione

Continua neurogenesi nell'ippocampo del cervello dei mammiferi adulti fornisce un sistema unico modello sperimentale per lo studio dello sviluppo neuronale e di integrazione nel cervello maturo. Il protocollo presentato qui combina etichettatura retrovirali e metodi elettrofisiologici per studiare l'integrazione del neonato neuroni granulari dentato nel cervello dei topi adulti.

Per garantire che gli esperimenti hanno avuto successo, si raccomanda quanto segue durante le fasi critiche della procedura:

Per evitare l'infezione indesiderati e l'infiammazione, tutti gli strumenti devono essere sterilizzati (in autoclave, qualsiasi tipo di sterilizzatore, o etanolo al 70%) prima dell'intervento chirurgico. Usa PBS sterile per lavare la punta di un ago della siringa prima dell'iniezione.

Per l'iniezione del virus, gli animali devono essere ben montato sul dispositivo stereotassico e le fonti di movimenti inutili deve essere minimizzato durante l'iniezione. Assicurarsi che la testa è ben fisso e fermo, e regolare la posizione naso del mouse per livello bregma e lambda prima del calcolo delle coordinate di iniezione. Estratto del virus nella siringa rapidamente per ridurre al minimo l'esposizione a temperature ambiente - i retrovirus sono particolarmente sensibili alla temperatura. Iniettare lentamente virus al tasso raccomandato per minimizzare i danni di pressione. Utilizzando la raccomandata a punta piatta siringa (vs comune punta smussata) assicurerà un uniformemente distribuita zona infezione giro dentato.

Prima di preparare le fette, il taglio e la incubazione ACSF soluzione deve essere bollito con il 95% di CO O ₂ -5% ₂ per almeno 30 minuti per consentire l'ossigeno per saturare le soluzioni. Gli animali devono essere perfusi rapidamente e il tessuto mantenuto a freddo, soluzione satura di ossigeno per una migliore qualità fetta.

Per la registrazione, aumentare l'intensità dello stimolo a poco a poco fino a quando c'è una risposta postsinaptica. Cambiare la posizione degli elettrodi di stimolazione all'interno dello strato molecolare del giro dentato, se necessario.

In sintesi, l'approccio raccomandato offre un modo per esplorare le proprietà distinte e possibili ruoli funzionali di neuroni adulti, nato durante la fase iniziale di integrazione in attivo, circuito maturo.

Materiali

• Taglio soluzione (in mm): 110 cloruro di colina, 2.5 KCl, 1.3 KH ₂ PO _4, 25,0 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 destrosio, 1,3 ascorbato di sodio, 0,6 piruvato di sodio, 5,0 acido kynurenic.
• Artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF, in mm): 125,0 NaCl, 25,0 NaHCO _3, 2.5 KCl, 2 CaCl _2, 1,3 KH ₂ PO _4, 1.3 _MgCl2, 1,3 ascorbato di sodio, 0,6 di sodio piruvato, 10 destrosio.
• Soluzione interna per intero a cellule patchclamp (in mm): 120 gluconato di potassio, 15 KCl, 4 MgCl _2, 0,1 EGTA, HEPES 10,0, 4 MgATP, 0,3 Na ₃ GTP, 7 fosfocreatina (pH 7.4, 300 mOsm).