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1. Finger-Stick prelievo di sangue
- Raccolta di sangue intero è di solito presi a riposo per una misura di base (di solito dopo 10-15 resto seduto min), durante o immediatamente dopo un attacco di esercizio, e per tutto il periodo post-esercizio (in genere da 1-3 ore dopo la cessazione del esercizio fisico).
- Utilizzando le precauzioni universali, in primo luogo sterilizzare la punta del dito con il 70% di alcool isopropilico.
- Successivamente, la puntura il sito utilizzando un bisturi automatici o dispositivi simili. Anche se si usa un 30-gauge bisturi per offrire il comfort soggetto, un ago di diametro più ampio potrebbero essere utilizzati.
- Eliminare la prima goccia di sangue, e poi raccogliere in provette di sangue capillare o microvettes trattati con litio eparina per prevenire la coagulazione.
2. Fenotipizzazione delle cellule e colorazione apoptosi
- Aggiungere 10 microlitri di sangue intero eparinizzato al pannello di anticorpi titolati in 250 microlitri di buffer vincolanti (vedi tabella 1 schema). Abbiamo usato un fattore di diluizione 1:20 con successo, ma ogni laboratorio dovrebbe titolo i loro reagenti per determinare la migliore soluzione di lavoro.
Tabella 1. Pannello di anticorpi per la determinazione di esercizio apoptosi indotta in sottoinsiemi dei leucociti. Apoptosi precoce è stato definito mediante l'espressione di annessina V, mentre l'apoptosi in ritardo è stato definito con un doppio etichettatura positiva con annessina V e 7-AAD. Le cellule necrotiche erano annessina V e 7-AAD + solo le celle.
| Provetta 1 | Provetta 2 | Tubo 3 | Tubo 4 |
| Solo le cellule del tubo | Annessina V - FITC | Annessina V - FITC | Annessina V - FITC |
| Anti CD4 umano - PE | Anti umane CD8 - PE | Anti umani CD19 - PE |
| 7-AAD | 7-AAD | 7-AAD |
| Anti umani CD45RA - APC | Anti umani CD45RA - APC | |
7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfociti T helper, CD8 = soppressore / linfociti T citotossici, i linfociti B CD19 =, CD45RA = sottopopolazioni cellulari ingenuo, FITC = isotiocianato di fluorescina, PE = ficoeritrina. - Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
- Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
- Decantare, aggiungere 300 ul Red Cell Lysis Buffer sangue, e completamente vortice.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 300 ml di PBS per fermare la reazione di lisi.
- Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
- Decantare, rack, e aggiungere 50 microlitri di buffer vincolanti.
- Analizzare mediante citometria di flusso.
Si raccomanda, come minimo, i seguenti controlli da utilizzare: un solo tubo di cellule per servire come controllo negativo nel rilevare autofluorescenza sfondo, e le provette contenenti ciascuno fluorocromo per impostare compensazione durante l'impostazione iniziale della citometria a flusso. Inoltre, abbiamo utilizzato perline standard di compensazione con successo per creare i nostri esperimenti.