Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Questa procedura può essere eseguita in 500 microlitri tubi siliconato o 6 ml in polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Quest'ultimo è normalmente utilizzati nello svolgimento di analisi di fattibilità in collaborazione con altre procedure. Tutti i volumi indicati sono per 6 ml di polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Per 500 microlitri tubi di silicone e ridurre tutti i volumi da 1 / 5.

La concentrazione ottimale per l'analisi di citometria a flusso è di 2-4 x 10 ⁶ cellule per volume di 200 microlitri. Perdita di cellule possono derivare da questa procedura, e quindi si consiglia di ogni campione è composto da 4 x 10 ⁶ cellule all'inizio della procedura.

1. Preparazione delle cellule

1. Celle di raccolta - si riferiscono a procedure specifiche per le linee di cellule corrispondente o isolamenti cellula primaria.
2. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante.
3. Risospendere le cellule in 2 ml 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ^{- / -} (senza calcio, senza magnesio).
4. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante.
5. Risospendere le cellule in 1 ml di buffer di 1 x annessina V vincolanti.
6. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in 100 ul buffer di 1 x annessina V vincolanti.

2. Applicazione di annessina V / PI Stain

1. Aggiungi annessina V in base alle raccomandazioni del fabbricante [ad esempio 5 microlitri annessina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
2. Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 100 ml di buffer di 1 x annessina V vincolante per ciascun tubo di reazione. Ci dovrebbe essere di circa 200 l in ciascun tubo.
4. Aggiungere 4 ml di PI (Sigma, Cat # P-4864-10ML) che è stato diluito 1:10 in 1 tampone x annessina V vincolante (cioè 1 PI microlitri con 9 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante). Questo produrrà una concentrazione finale PI di 2 mg / ml in ciascun campione.
5. Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 500 microlitri di buffer 1 x annessina V vincolante per lavare le cellule.
7. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante.
8. Risospendere le cellule in 500 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante e 500 microlitri di formaldeide al 2% per creare una soluzione all'1% di formaldeide (fissativo). Mescolare tubi da sfogliando gentile.
9. Fissare i campioni in ghiaccio per 10 minuti. In alternativa, i campioni possono essere conservati notte a 4 ° C al buio. Se il metodo di quest'ultimo è scelto, assicuratevi di essere coerente in tutti i tubi etichettati con annessina V / PI (compresi i controlli di compensazione).
10. Aggiungere 1 ml 1 x PBS ^{- / -} per ogni campione e miscelare delicatamente sfogliando.
11. Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti e decantare il surnatante.
12. Ripetere i passaggi 2.10 e 2.11.
13. Risospendere le sfere muovendo il tubo.
14. Aggiungere 16 ml di diluito 1:100 RNAsi A (Sigma, R4642) per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Incubare per 15 minuti a 37 ° C.
15. Aggiungere 1 ml 1 x PBS ^{- / -} e mescolare delicatamente dal sfogliando.
16. Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti.
17. I campioni sono ora pronti per essere analizzati. In alternativa, i campioni possono essere utilizzati per la colorazione passi successivi se annessina / PI colorazione viene eseguita in parallelo con altre procedure.

3. Rappresentante dei risultati:

Esempi di tipi di cellule e linee cellulari che presentano diversi gradi di falsi positivi colorazione PI sono mostrati in Figura 1. Per spiegare il falso-positivi gli eventi, le cellule sono state fissate e poi trattati con RNasi A. Questo si traduce in una diminuzione significativa del numero di falsi positivi eventi, rispetto alle cellule che non siano sottoposti a trattamento RNasi (Figura 2B). Figura 2C mostra immagini rappresentative di cellule che sottoposti a trattamento RNAsi, rispetto alle cellule che non ha avuto un trattamento RNAsi. La Figura 3 mostra come la modifica annessina V / PI protocollo, con la fissazione e fasi di trattamento RNase, migliora protocolli convenzionali, limitando il numero di falsi positivi eventi di colorazione.

Figura 1. Protocolli di colorazione convenzionale propidio ioduro di portare ad un significativo numero di falsi eventi positivi. Abbiamo già valutato estensione della colorazione falsa positiva attraverso le cellule primarie attraverso una vasta gamma di modelli animali e in una varietà di linee cellulari ^10. Immagini rappresentative mostrano estensione della colorazione falsa positiva in tre popolazioni di cellule unico (una linea cellulare di uso comune - macrofagi RAW e due cellule primarie - murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM)). La vera eventi positivi visualizzare l'atteso co-localizzazione tra PI e DRAQ5 all'interno del compartimento nucleare (aree giallo raffigurano colocalizzazione tra PI e DRAQ5). DRAQ5 è altamente membranene permeabile colorante che con precisione le macchie vano nucleare in cellule vive e morte ^10,11,12. Per facilitare la determinazione visiva della colocalizzazione DRAQ5 macchia è stata data una pseudocolour verde.

Figura 2. Migliorare l'accuratezza della colorazione PI nucleare. (A) hanno valutato l'accuratezza della colorazione PI nucleare basato sul grado di similarità di una serie di ben caratterizzato macchie nucleare (BrdU, 7-AAD e DAPI) per DRAQ5. BrdU è un nucleoside sintetico che viene incorporato nel DNA delle cellule proliferanti, e come tale sarà unica macchia all'interno del compartimento nucleare. 7-AAD ha un'alta affinità per il DNA e, simile a PI, non può attraversare una membrana plasmatica intatto. DAPI ha anche una forte affinità per il DNA nucleare ed è il più comunemente usato macchia nella microscopia a fluorescenza. Il grado di somiglianza era> 99% tra BrdU, 7-AAD, DAPI e DRAQ5, evidenziando la loro capacità di macchiare con precisione il nucleo della cellula in macrofagi RAW 264.7. Al contrario, la colorazione citoplasmatica PI sulla base di protocolli convenzionali porta ad una diminuzione marcata somiglianza per cento della colorazione rispetto al DRAQ5. (B) Risultati simili sono stati osservati in due cellule primarie testate: murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM). L'incorporazione di 50 mg / ml RNasi A in fase di specifici all'interno della procedura di colorazione rimuove non nucleari colorazione PI e aumenta in modo significativo il grado di somiglianza rispetto alla DRAQ5 colorazione. (C) immagini Rappresentante dei macrofagi renali primari mostrano il grado di somiglianza per celle con e senza trattamento RNAsi. Per facilitare la determinazione visiva delle differenze tra i trattamenti, DRAQ5 è stata data una verde. Aree giallo raffigurano colocalizzazione tra BrdU e DRAQ5 e PI e DRAQ5.

Figura 3. Modificato annessina V / PI riduce significativamente l'apoptosi false / eventi necrotico. Macrofagi primari reni pesci rossi (PKM) sono state colorate con convenzionali e modificato annessina V / PI protocolli. Scatterplot raffigurano l'annessina V / PI macchia in PKM pesci rossi. La dispersione a sinistra mostra convenzionale annessina V / PI colorazione (non RNasi) di cellule PKM. La dispersione a destra mostra PKM cellule colorate con il annessina V modificato / PI protocollo (con RNasi). L'aggiunta di risultati RNase in una marcata riduzione della colorazione PI a causa della rimozione di macchie di falsi positivi. PKM cellule sono state poi analizzate in base a distinte popolazioni all'interno delle culture e l'inizio progenitori (PE), monociti (Mono) e macrofagi maturi (Mat mac). La riduzione del numero di eventi PI positivo, dovuto alla rimozione del falso eventi positivi è più pronunciata nelle grandi cellule macrofagi maturi che in piccole cellule progenitrici presto. Conclusioni basate su protocolli convenzionali avrebbe erroneamente suggerito una correlazione positiva con la morte cellulare per i sottoinsiemi dei macrofagi più maturi.