Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Sommario

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Abstract

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali dalla neocorteccia del ratto. A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, abbiamo adottato un approccio genetico per manipolare l'espressione dei canali. Noi usiamo una preparazione organotipica cultura (16) al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Noi di solito isolare acuta fette neocorticale a 8-10 giorni dopo la nascita e mantenere le fette in coltura per 3-7 giorni. Questo ci permette di studiare i neuroni ad un'età simile a quella nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificati neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l'interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Noi usiamo biolistic (pistola Gene) trasfezione di tipo selvaggio o del DNA mutante canale del potassio per manipolare l'espressione dei canali per studiare la loro funzione. Le cellule trasfettate sono facilmente identificabili mediante microscopia in epifluorescenza dopo la co-trasfezione con cDNA per la proteina fluorescente verde (GFP). Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione.

Protocollo

1. I preparativi prima del giorno del Slicing

Troviamo è più efficiente di autoclavare gli strumenti chirurgici e preparare soluzioni prima del giorno di affettamento.

1. Autoclave strumenti. (L'intervento e affettamento avvengono sotto condizioni di semi-sterile). Autoclave i seguenti pacchetti, confezionati singolarmente in carta autoclave:
   • Chirurgia pacchetto: spatola, # 22 manico bisturi, forbici, pinze
   • Pacchetto slicing: 3 manopole (lama tenuta di manopola e 2 bagni di fissaggio manopole) e Protezione del disco (contiene lametta da affettatrice: Campden Vibrosl....

Discussione

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali da ratto neocorteccia (4, 9-11). A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, usiamo un approccio genetico per manipolare l'espressione canale (1,14,15,17-19). Utilizziamo una preparazione organotipica cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificata da un approccio di Stoppini et al (16), al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare del.......

Materiali

Chirurgia / trasfezione / cultura:

1. Cervello Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA
2. Sistema Gun gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
   • Include: pistola Gene, assemblaggio tubo flessibile con regolatore di elio, tubi stazione della preparazione (# 165-2418), siringa kit, tubi Tefzel, taglio tubi, ottimizzazione kit (# 165-2424), taglio tubi
   • Bio-Rad Elio Regolatore (# 165-2413)
   • materiali di consumo usa e getta per Helios da Bio-Rad:
     • Microcarriers 1,6 micron oro: # 165-2264
     • Tefzel Tubing: # 165-2441
3. Incubatore: modello Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifiche: (866) 984-3766).

Media:

1. Siero di cavallo: Hyclone donatore equino SH # 30074. (Hyclone, 925 Sud Occidentale 1800, Logan, UT 84321)
2. HMEM (Minimal Essential Media più HBSS e HEPES, non glutammina: Lonza BioWhittaker catalogo # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1.
3. HBSS (GIBCO Hanks soluzione salina tamponata, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1.
4. MEM (GIBCO terreno minimo indispensabile, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1.
5. 250 ml Millipore 0,2 micron filtro: # SC6PU02RE
6. Pipette di plastica di trasferimento: Fisher # 13-711-20.
7. 50 mL Millipore steriflip 0,22 micron filtro (# SCGP00525)

Elementi 6-8 ottenuto a partire da: Fisher Scientific, 1241 Ambasciatore Blvd., PO Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Registrazione:

1. Pipetta di vetro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 ottobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
2. Sutter P-87 estrattore orizzontale elettrodo: Strumento azienda Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949
3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplificatore: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
4. PClamp 10 software di acquisizione dati: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
5. posizione lectrode è controllato con Sutter ROE manipolatori-200 e PC-200 controller: Instrument Company Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
6. Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio in posizione verticale con IR-DIC ottica
7. IR sensibile fotocamera OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 del Nord Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).