Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Sommario

Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.

Abstract

La natura eterogenea di tipi cellulari nel testicolo e l'assenza di modelli di coltura cellulare meiotico sono stati ostacoli significativi allo studio dei programmi di differenziazione unico che si manifestano durante la meiosi. Due metodi principali sono state sviluppate per purificare, a livelli diversi, diverse frazioni meiotica sia da adulti e animali immaturi: elutriation o Staput (sedimentazione) utilizzando la BSA e / o gradienti di Percoll. Entrambi questi metodi si basano sulla dimensione della cella e la densità di separare le cellule meiotico ^1-5. Nel complesso, ad eccezione di popolazioni cellulari pochi ^6, questi protocolli non riescono a produrre una sufficiente purezza delle numerose popolazioni di cellule meiotica che sono necessari per la dettagliata analisi molecolari. Inoltre, con questi metodi di solito un tipo di cellule meiotico può essere purificato in un dato momento, che aggiunge un ulteriore livello di complessità quanto concerne la riproducibilità e omogeneità nel confronto tra campioni di cellule meiotica.

Qui, descriviamo un metodo raffinato che permette di visualizzare facilmente, identificare e purificare cellule meiotico, da cellule germinali di spermatidi rotondi, usando FACS combinato con Hoechst 33342 colorazione ^7,8. Questo metodo fornisce una fotografia complessiva dell'intero processo meiotico e permette di purificare cellule vitali altamente dalla maggior parte fase della meiosi. Queste cellule purificate possono poi essere analizzati in dettaglio i cambiamenti molecolari che accompagnano la progressione attraverso la meiosi, per esempio le modifiche nell'espressione genica ^9,10 e le dinamiche di occupazione nucleosoma presso gli hotspot di ricombinazione meiotica ^11.

Protocollo

Questo protocollo può essere diviso in due fasi principali: (1) la colorazione 33342 dissociazione e Hoechst di mouse cellule testicolo seguito, se necessario, (2) FACS ordinamento delle frazioni rilevanti meiotico, comprese tutte le fasi della meiosi, da cellule germinali di spermatidi rotondi. Una volta raccolte, queste popolazioni altamente arricchito meiotica può essere utilizzato per una vasta gamma di analisi. Questo protocollo descrive la dissociazione di un testicolo adulto; volumi possono essere adattate di conseguenza per i minori o per testicoli aggiuntivi.

1. Testicolo dissociazione

1. Mettete un testicolo decapsulated....

Discussione

Il protocollo presentato qui permette di purificare contemporaneamente da topi maschi adulti l'intera gamma delle cellule stadio meiotico con purezza molto elevata, permettendo agli investigatori di studiare la dinamica di questo processo fondamentale. Cellule purificate possono essere utilizzati per numerose applicazioni che vanno dalla RNA ^9,10, la mappatura nucleosoma ^11, il rilevamento molecola ricombinante, analisi delle proteine, e molti altri. Tuttavia, i metodi di rilevazione devono ess.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi di Tipo-1	Worthington Biochemical	CLSS1	Sciogliere a 12.000 U/ml in GBSS, conservare a 4°C
Tripsina	Worthington Biochemical	TRL3	Sciogliere in HCl 1 mM a 50 mg/ml, conservare a 4°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Soluzione satura (10 mg/ml in DMSO), conservare a 4°C
DNAse I	Sigma-Aldrich	DNEP	Sciogliere in acqua/glicerolo al 50% a 1 mg/ml, conservare a -20°C
Soluzione Salina Bilanciata di Gey’s	Sigma-Aldrich	G9779
Pipetta di trasferimento da 6"	Fisher Scientific	137119D