Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Sommario

Descriviamo un metodo di misurazione dell'energia di legame, esprimibile come la tensione superficiale dei tessuti, tra le cellule all'interno del tessuto 3D-come aggregati. Le differenze di tensione superficiale del tessuto hanno dimostrato di correlare con l'invasività del polmone, dei muscoli, e tumori al cervello, e sono determinanti fondamentali di stabilire relazioni spaziali tra i diversi tipi di cellule.

Abstract

Su misurazioni rigorose degli intercellulare energia di legame può essere effettuato solo con metodi fondati principi termodinamici in sistemi all'equilibrio. Abbiamo sviluppato superficie tensiometry tessuto (TST) specificamente per misurare l'energia libera della superficie di interazione tra le cellule. I concetti alla base biofisica TST sono stati precedentemente descritti in dettaglio ^1,2. Il metodo si basa sull'osservazione che le cellule reciprocamente coesa, se mantenuta in agitazione cultura, si assemblano spontaneamente in cluster. Nel corso del tempo, questi cluster si completano a formare sfere. Questo arrotondamento comportamento simula il caratteristico comportamento dei sistemi liquidi. Intercellulare energia di legame è misurata comprimendo aggregati sferici tra piatti paralleli in un design personalizzato tensiometro tessuto superficiale. La stessa equazione matematico utilizzato per misurare la tensione superficiale di una goccia di liquido viene utilizzato per misurare la tensione superficiale del tessuto 3D-come aggregati sferici. L'equivalente cellulare della tensione superficiale liquido intercellulare energia di legame, o più in generale, cohesivity tessuti. Studi precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che la tensione superficiale dei tessuti (1) predice come due gruppi di cellule embrionali potranno interagire tra loro ^1-5, (2) può influenzare fortemente la capacità dei tessuti di interagire con biomateriali ^6, (3) può essere modificato non solo attraverso la manipolazione diretta di caderina-based coesione intercellulare ^7, ma anche per la manipolazione di molecole chiave ECM come FN ^8-11 e 4) si correla con potenziale invasivo di cancro al polmone ^12, fibrosarcoma ^{13, 14} e tumore al cervello tumore alla prostata linee cellulari ^15. In questo articolo andremo a descrivere l', particolare dell'apparato i passaggi necessari per generare sferoidi, per caricare il sferoidi nella camera di tensiometro, di avviare la compressione aggregati, e per analizzare e convalidare le misure di tensione superficiale del tessuto generato.

Protocollo

1. Preparazione aggregato per la misura della tensione superficiale dei tessuti.

Per le cellule aderenti, sferoidi può essere formata utilizzando il metodo goccia o generando un foglio coerente di cellule che possono poi essere tagliato in frammenti di 1 mm.

Formazione di aggregati con il metodo goccia pendente:

1. Quasi confluenti colture di cellule aderenti dovrebbe essere cresciuta al 90% di confluenza, monostrati dopo di che devono essere risciacquati due volte con PBS. Dopo aver svuotato bene, aggiungere 2 ml (per 100 piastre mm) del 0,05% tripsina-1 mM EDTA, e incubare a 37 ° C fino a staccare le ce....

Discussione

Misurare la coesione aggregato da TST è relativamente semplice. Vi sono, tuttavia, passaggi chiave che deve essere padroneggiato al fine di generare dati TST utilizzabile; 1) aggregati deve essere "sano". Questo può essere controllato facendo in modo che la formazione di aggregati inizia con le cellule che sono alla confluenza ottimale prima di distacco. Formato aggregato e l'ora in cultura deve essere controllato anche a minimizzare lo sviluppo di un core necrotico all'interno dell'aggregato, 2) U.......

Materiali

• acqua bagno / agitatore (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml a fondo sferico (Belco, Vineland, NJ)