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Le cellule dendritiche (DC) può essere considerato sentinelle del sistema immunitario che svolgono un ruolo critico nella sua iniziazione e la risposta alle infezioni 1. Rilevazione dell'antigene patogeni da DC ingenuo è attraverso i recettori pattern recognition (PRR) che sono in grado di riconoscere specifiche strutture conservate denominate modelli molecolari patogeni associati (PAMPs). Rilevazione di PAMPs da DC innesca una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente loro attivazione e la trasformazione di DC mature. Questo processo è tipicamente caratterizzata da produzione di interferone di tipo 1 insieme ad altre citochine proinfiammatorie, sovraregolazione di marcatori cellulari di superficie come MHCII e CD86 e la migrazione delle DC mature ai linfonodi drenanti, dove l'interazione con le cellule T avvia la risposta immunitaria adattativa 2, 3. Così, DC collegare i sistemi immunitario innato e adattativo.
La capacità di sezionare le reti molecolari alla base della risposta DC a vari agenti patogeni è fondamentale per una migliore comprensione del regolamento di queste vie di segnalazione e le loro geni indotti. Dovrebbe anche contribuire a facilitare lo sviluppo di DC-based vaccini contro le malattie infettive e tumori. Tuttavia, questa linea di ricerca è stato gravemente ostacolato dalla difficoltà di trasfezione primario DC 4.
Metodi di trasduzione del virus, come il sistema lentivirale, sono tipicamente utilizzati, ma portano molti limiti come la complessità e bio-pericolosi rischio (con i costi associati) 5,6,7,8. Inoltre, la consegna dei prodotti gene virale aumenta l'immunogenicità di coloro trasdotte DC 9,10,11,12. Elettroporazione è stata utilizzata con risultati alterni 13,14,15, ma siamo i primi a segnalare l'utilizzo di un high-throughput protocollo di trasfezione e definitivamente dimostrare la sua utilità.
In questa relazione si riassumono un protocollo ottimizzato commerciale high-throughput per la transfezione di DC umane primarie, con limitata tossicità delle cellule e l'assenza di maturazione DC 16. L'efficienza di trasfezione (di plasmide GFP) e la vitalità delle cellule erano più del 50% e 70% rispettivamente. FACS analisi stabilito l'assenza di aumento di espressione della maturazione e MHCII marker CD86 in cellule trasfettate, mentre qRT-PCR ha dimostrato di non sovraregolazione IFNβ. Usando questo protocollo di elettroporazione, forniamo le prove per la trasfezione di successo di DC con siRNA ed efficace di abbattere genica mirata RIG-I, un recettore chiave riconoscimento virale 16,17, sia a livelli di mRNA e proteine.