Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Sommario

Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.

Abstract

Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro nelle donne e ha un tasso di mortalità del 63% negli Stati Uniti ^1. Il tipo di cellula d'origine dei tumori ovarici è ancora in discussione e potrebbe essere sia l'epitelio della superficie ovarica (OSE) o l'epitelio distale del fimbrie tube di Falloppio ^2,3. Coltura le cellule normali come una coltura primaria in vitro consentirà agli scienziati di modello cambiamenti specifici che potrebbero portare al cancro ovarico nell'epitelio distinti, così definitivamente la determinazione del tipo di cellula di origine. Ciò permetterà lo sviluppo di biomarcatori più precisi, modelli animali con tessuto-specifici cambia gene, e migliori strategie di prevenzione mirate a questa malattia.

Il mantenimento di cellule normali in idrogel alginato promuove a breve termine in coltura in vitro di cellule nel loro contesto tridimensionale e permette l'introduzione di DNA plasmidico, siRNA e piccole molecole. Dagli organi coltura in pezzi che sono derivati ​​da tagli strategici con un bisturi, le culture diverse da un singolo organo può essere generato, aumentando il numero di esperimenti da un singolo animale. Questi tagli aspetti del modello di ovulazione porta alla proliferazione di OSE, che è associata alla formazione di cancro ovarico. Tipi di cellule come l'OSE, che non crescono bene su superfici in plastica possono essere coltivate con questo metodo e facilitare l'indagine nei normali processi cellulari o dei primi eventi nella formazione del cancro ^4.

Idrogel alginato può essere utilizzato per sostenere la crescita di molti tipi di tessuti ^5. Alginato è un polisaccaride lineare composto da unità ripetute di β-D-mannuronico acido e α-L-guluronic acido che può essere reticolato con gli ioni calcio, con una conseguente azione gelificante delicata che non danneggiano i tessuti ^6,7. Come per le altre cellule matrici tridimensionali cultura come Matrigel, alginato fornisce supporto meccanico per i tessuti, ma le proteine ​​non sono reattivi con la matrice di alginato, e quindi le funzioni alginato come matrice extracellulare sintetico che non avvia segnalazione cellulare ^5. L'idrogel alginato galleggia in media standard di coltura cellulare e supporta l'architettura della crescita dei tessuti in vitro.

Un metodo viene presentato per la preparazione, la separazione, e l'inclusione di neoplasie ovariche e composizioni per organo oviductal in idrogel alginato, che possono essere mantenute in coltura per un massimo di due settimane. Il rilascio enzimatico delle cellule per l'analisi di campioni di RNA e proteine ​​dalla cultura organo è anche descritto. Infine, la crescita di tipi di cellule primarie è possibile senza immortalizzazione genetica di topi e permette agli investigatori di utilizzare knockout e topi transgenici.

Protocollo

1. Ovarico dissezione e isolamento dei tessuti

1. Preparare una soluzione allo 0,5% (w / v) di alginato di sodio, preparare da una versione modificata del protocollo descritto in precedenza ^5, utilizzando PBS sterile e calore a 37 ° C. Miscelare invertendo o dondolo, ma non vortice. Disegnare la alginato in una siringa da 1 ml con un ago da 25 G e mantenere a 37 ° C.
2. Preparare 10mM sterile CaCl ₂ soluzione per la reticolazione alginato su incapsulamento dei tessuti e calda a 37 ° C.
3. Preparare 1 ml di terreno di coltura (αMEM + 5 unità di penicillina e 5 mg / ml di streptomicina) per bene in un 24 pozzetti per ciascun ....

Discussione

Lo sviluppo di un sistema tridimensionale di organi cultura utilizzando idrogel alginato rappresenta un metodo versatile per l'analisi di molti tipi di tessuto diverso da una grande varietà di organismi. L'uso di colture 3D può essere estesa ai campi della ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa in quanto fornisce una impalcatura su cui le cellule possono crescere ^11. Attualmente, il nostro laboratorio è in fase di studio iniziale, usando il tessuto ovarico umano e tube di Falloppio, tuttavia, .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Leibovitz L-15 di media	Gibco	11415
αMEM media	Gibco	12000-022
Alginato di sodio	Novamatrix
Sodio cacodilato	Sigma Aldrich	C0250
Rete in fibra di polipropilene	McMaster Carr		45 "di larghezza rotolo; 0,0041" apertura
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Penicillina / streptomicina	Gibco	15070-063
Alginato liasi	Sigma Aldrich	A1603
A1603	Sigma Aldrich	C9697	Da Clostridium histolyticum
Albumina di siero bovino	MP Biomedicals	103700
Siero fetale bovino	Gibco	Gibco
ITS	Roche	11074547001	Insulina / transferrina / sodio selenite
Citocheratina 8 anticorpi	Developmental Studies Ibridoma Banca	Troma-1	Uso a 1:200
DAPI	Vector Labs	H1200
Bromodeossiuridina	Sigma	B50002-1G	Concentrazione finale di 10 micron