Immuno-fluorescenza saggio di Leptospiral superficie esposti Proteine

Sommario

Un metodo efficace per valutare l'esposizione superficiale di proteine ​​leptospiral è descritto. Il metodo è specificamente progettato per evitare l'interruzione della membrana esterna delle cellule fragili leptospiral. Questa tecnica richiede l'impiego di diversi controlli negativi per valutare l'integrità della membrana esterna e la specificità della reazione anticorpale.

Abstract

Proteine ​​della superficie batterica sono coinvolti in contatto diretto con le cellule ospiti e l'assorbimento delle sostanze nutritive dall'ambiente ^1. Per questo motivo, localizzazione cellulare in grado di fornire intuizioni sul ruolo funzionale delle proteine ​​batteriche. Localizzazione superficiale delle proteine ​​batteriche è un passo fondamentale verso l'identificazione dei fattori di virulenza coinvolti nei meccanismi di patogenicità.

Metodi per frazionamento leptospiral ^2-5 membrane può essere selettivo per una certa classe di proteine ​​di membrana esterna (OMP), come lipoproteine ​​vs OMP transmembrana, e quindi portare a errata classificazione. Questo probabilmente è dovuto a differenze strutturali e come essi sono associati alla membrana esterna. Le lipoproteine ​​sono associati alle membrane attraverso una interazione idrofobica tra N-terminale porzione lipidica (tre acidi grassi) e dei fosfolipidi doppio strato lipidico ^{6, 7.} Al contrario, OMP transmembrana sono tipicamente integrate nel doppio strato lipidico da anfipatiche β-fogli disposti in una botte struttura simile ^{8, 9.} Inoltre, la presenza di una proteina nella membrana esterna non garantisce necessariamente che la proteina oi suoi domini sono esposte sulla superficie. Spirochete membrane esterne sono noti per essere i metodi fragile e occorre, pertanto coinvolgono la manipolazione dolce delle cellule e l'inclusione di sub-superficie proteina controlli per valutare l'integrità della membrana esterna.

Qui, presentiamo una immunofluorescenza saggio (IFA) per valutare direttamente l'esposizione di proteine ​​sulla superficie leptospire intatto. Questo metodo si basa sul riconoscimento delle proteine ​​di superficie leptospiral da antigene-anticorpi specifici. Qui, gli anticorpi specifici per OmpL54 ¹⁰ sono detetcted aftero vincolanti per natale, epitopi superficie esposta. Confronto di reattività anticorpi contro le cellule intatte permeabilizzate consente la valutazione della distribuzione cellulare e se non è selettivo una proteina presente sulla superficie leptospiral. L'integrità della membrana esterna deve essere valutato utilizzando anticorpi ad una o più proteine ​​del sottosuolo, preferibilmente situato nel periplasma.

Il metodo IFA superficie può essere utilizzato per analizzare l'esposizione superficie di qualsiasi proteina leptospiral a cui gli anticorpi specifici sono disponibili. Sia l'utilità e la limitazione del metodo dipende dal fatto che gli anticorpi utilizzati sono in grado di legarsi agli epitopi nativi. Dal momento che gli anticorpi sono spesso sollevate contro proteine ​​ricombinanti, di epitopi nativi, superficie esposta proteine ​​potrebbe non essere riconosciuto. Tuttavia, il metodo superficie IFA è uno strumento prezioso per lo studio delle componenti intatte superfici batterica. Questo metodo può essere applicato non solo per leptospire, ma anche spirochete e altri batteri gram-negativi. Per i più forti conclusioni sulla superficie-esposizione di OMP, un approccio globale che coinvolga diversi metodi di localizzazione delle cellule si consiglia ^10.

Protocollo

1. Fissazione di Leptospira di vetrini

1. Leptospira interrogans è una classe BSL2 patogeno. Lavorando con cellule vive che richiede una gestione appropriata, ad esempio i guanti, camice e fasi di pipettamento in una sterile-cappuccio.
2. Crescere Leptospira in EMJH medium11, integrato con siero di coniglio 1% a 30 ° C fino a raggiungere metà e la fine-log fase (densità di 5 x 10 ⁷ a 5 x 10 ⁸ cellule / ml) per circa 6 giorni.
3. Raccolta della cultura per centrifugazione a ~ 2000 xg per 7 minuti a temperatura ambiente.
4. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere delicatamente il pellet in t....

Discussione

La nostra tecnica IFA superficie è simile a quello utilizzato per dimostrare l'esposizione superficie di vari borrelial ^{15, 16} e leptospiral ^{12, 17} proteine. I dettagli del metodo superficie IFA qui descritti sono stati progettati per ridurre al minimo la manipolazione di cellule, nel tentativo di mantenere l'integrità della membrana esterna sfruttando la tendenza delle cellule Leptospira di aderire alle diapositive di vetro. Il metodo prevede una concentrazione più bassa (2% versus 4%) di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Due pozzetti camera di vetrini	Lab-Tek	177380
Siero di coniglio	Rockland Immunochemicals	D209-00-0100
Leptospira arricchimento EMJH	BD Difco	279510
Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L)	Invitrogen / Molecular Probes	A-11034
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L)	Invitrogen / Molecular Probes	A-11029
4'6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato (DAPI)	Invitrogen / Molecular Probes	D1306
Prolungare oro anti-sbiadimento mezzo di montaggio	Invitrogen / Molecular Probes	P36930	A temperatura ambiente prima dell'uso
Fisherfinest Premium di vetro di copertura	Pescatore	12-544-14
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	Axioskop 40