Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo di cellule staminali emopoietiche

Sommario

Un Ex vivo Protocollo per generare le cellule mature del sangue umano rossi da staminali ematopoietiche / progenitori è descritto. Inoltre descriviamo un efficiente lentivirale consegna metodo per atterramento TAL1 il fattore di trascrizione in cellule primarie eritroidi. L'efficienza della consegna del gene mediato lentivirus è dimostrata utilizzando virus GFP che esprimono.

Abstract

Eritropoiesi è un sistema modello comunemente utilizzato per studiare la differenziazione cellulare. Durante l'eritropoiesi, pluripotenti adulte cellule staminali emopoietiche (CSE) si differenziano in cellule progenitrici oligopotent, precursori e globuli rossi maturi ^1. Questo processo è regolato in gran parte a livello dell'espressione genica, in cui fattori di trascrizione specifici attivare lineage-specifici geni, mentre in concomitanza reprimendo i geni che sono specifici per altri tipi di cellule ^2. Gli studi sui fattori di trascrizione che regolano l'eritropoiesi sono spesso eseguite utilizzando linee cellulari umane e murine che rappresentano, in qualche misura, le cellule eritroidi in fasi dato di differenziazione ^3-5. Tuttavia le linee di cellule trasformate solo in parte imitare le cellule eritroidi e, soprattutto, non consentono di studiare comprensibile i cambiamenti dinamici che si verificano come un progresso cellule attraverso molte fasi verso il loro destino finale eritroide. Quindi, una sfida attuale rimane lo sviluppo di un protocollo per ottenere popolazioni di cellule staminali relativamente omogenea primarie e cellule eritroidi a vari stadi di differenziazione in quantità sufficienti per eseguire esperimenti di genomica e proteomica.

Qui si descrive un ex vivo di cellule protocollo cultura di indurre differenziamento eritroide umane ematopoietiche da cellule staminali / progenitrici che sono state isolate dal sangue del cordone ombelicale sia, midollo osseo, o adulto sangue periferico mobilizzate con G-CSF (leucaferesi). Questo sistema di coltura, inizialmente sviluppato dal laboratorio Douay ^6, utilizza citochine e co-coltura delle cellule mesenchimali per imitare il microambiente del midollo osseo. Usando questo protocollo differenziazione ex vivo, si osserva un forte amplificazione dei progenitori eritroidi, l'induzione della differenziazione esclusivamente verso il lignaggio eritroide e una completa maturazione allo stadio di enucleato globuli rossi. Così, questo sistema offre l'opportunità di studiare il meccanismo molecolare di regolazione trascrizionale come progresso cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide.

Studiare l'eritropoiesi a livello trascrizionale richiede anche la capacità di fattori specifici sovra-espresso o atterramento in cellule primarie eritroidi. A questo scopo, usiamo un lentivirus-mediata sistema di consegna gene che permette l'infezione sia efficiente divisione e non divisione delle cellule ^7. Qui mostriamo che siamo in grado di atterramento in modo efficiente il TAL1 fattore di trascrizione in cellule primarie umane eritroidi. Inoltre, l'espressione della GFP dimostra un'efficienza di infezione lentivirali vicino al 90%. Così, il nostro protocollo prevede un sistema molto utile per la caratterizzazione della rete di regolamentazione dei fattori di trascrizione che l'eritropoiesi controllo.

Protocollo

Parte I. Eritropoiesi ex vivo di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane

1. Isolamento di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane CD34⁺

La popolazione di cellule umane CD34⁺, che contiene una miscela di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e progenitori precoci⁸, viene isolata dal sangue del cordone ombelicale, dal sangue periferico mobilizzato con G-CSF (leucoaferesi) o dal midollo osseo (Figura 1-Passo 1). Se si utilizza il sangue del cordone o il sangue periferico, passare direttamente al passo 1.2. Se si utilizza il midollo osseo, iniziare dal p....

Discussione

Un certo numero di metodi sono stati utilizzati in precedenza per differenziare le cellule eritroidi in coltura con gradi variabili di successo. Per esempio, alcuni protocolli senza co-coltura su MS-5 consente l'espansione delle cellule eritroidi, ma non sono efficienti nella produzione di celle enucleato completamente maturo rosso sangue ^12-17. Mentre gli altri metodi permettono l'enucleazione efficiente, è a scapito della proliferazione ^18,19. Il metodo che abbiamo utilizzato qui, inizial.......