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Articolo metodologico

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo di cellule staminali emopoietiche

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⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 luglio 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

In questo articolo

Sommario

Un Ex vivo Protocollo per generare le cellule mature del sangue umano rossi da staminali ematopoietiche / progenitori è descritto. Inoltre descriviamo un efficiente lentivirale consegna metodo per atterramento TAL1 il fattore di trascrizione in cellule primarie eritroidi. L'efficienza della consegna del gene mediato lentivirus è dimostrata utilizzando virus GFP che esprimono.

Abstract

Eritropoiesi è un sistema modello comunemente utilizzato per studiare la differenziazione cellulare. Durante l'eritropoiesi, pluripotenti adulte cellule staminali emopoietiche (CSE) si differenziano in cellule progenitrici oligopotent, precursori e globuli rossi maturi 1. Questo processo è regolato in gran parte a livello dell'espressione genica, in cui fattori di trascrizione specifici attivare lineage-specifici geni, mentre in concomitanza reprimendo i geni che sono specifici per altri tipi di cellule 2. Gli studi sui fattori di trascrizione che regolano l'eritropoiesi sono spesso eseguite utilizzando linee cellulari umane e murine che rappresentano, in qualche misura, le cellule eritroidi in fasi dato di differenziazione 3-5. Tuttavia le linee di cellule trasformate solo in parte imitare le cellule eritroidi e, soprattutto, non consentono di studiare comprensibile i cambiamenti dinamici che si verificano come un progresso cellule attraverso molte fasi verso il loro destino finale eritroide. Quindi, una sfida attuale rimane lo sviluppo di un protocollo per ottenere popolazioni di cellule staminali relativamente omogenea primarie e cellule eritroidi a vari stadi di differenziazione in quantità sufficienti per eseguire esperimenti di genomica e proteomica.

Qui si descrive un ex vivo di cellule protocollo cultura di indurre differenziamento eritroide umane ematopoietiche da cellule staminali / progenitrici che sono state isolate dal sangue del cordone ombelicale sia, midollo osseo, o adulto sangue periferico mobilizzate con G-CSF (leucaferesi). Questo sistema di coltura, inizialmente sviluppato dal laboratorio Douay 6, utilizza citochine e co-coltura delle cellule mesenchimali per imitare il microambiente del midollo osseo. Usando questo protocollo differenziazione ex vivo, si osserva un forte amplificazione dei progenitori eritroidi, l'induzione della differenziazione esclusivamente verso il lignaggio eritroide e una completa maturazione allo stadio di enucleato globuli rossi. Così, questo sistema offre l'opportunità di studiare il meccanismo molecolare di regolazione trascrizionale come progresso cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide.

Studiare l'eritropoiesi a livello trascrizionale richiede anche la capacità di fattori specifici sovra-espresso o atterramento in cellule primarie eritroidi. A questo scopo, usiamo un lentivirus-mediata sistema di consegna gene che permette l'infezione sia efficiente divisione e non divisione delle cellule 7. Qui mostriamo che siamo in grado di atterramento in modo efficiente il TAL1 fattore di trascrizione in cellule primarie umane eritroidi. Inoltre, l'espressione della GFP dimostra un'efficienza di infezione lentivirali vicino al 90%. Così, il nostro protocollo prevede un sistema molto utile per la caratterizzazione della rete di regolamentazione dei fattori di trascrizione che l'eritropoiesi controllo.

Protocollo

Parte I. Eritropoiesi ex vivo di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane

1. Isolamento di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane CD34+

La popolazione di cellule umane CD34+, che contiene una miscela di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e progenitori precoci8, viene isolata dal sangue del cordone ombelicale, dal sangue periferico mobilizzato con G-CSF (leucoaferesi) o dal midollo osseo (Figura 1-Passo 1). Se si utilizza il sangue del cordone o il sangue periferico, passare direttamente al passo 1.2. Se si utilizza il midollo osseo, iniziare dal passo 1.1. Per reagenti e attrezzature, consultare la Tabella 1.

Questo passaggio viene eseguito in condizioni sterili (ad es. in cappa) e a temperatura ambiente (RT), salvo diversamente indicato.

  1. Preparare una sospensione di singole cellule del midollo osseo:
    1. Risospendere il midollo in 10 volumi di RPMI 1640 contenente 0,02% di collagenasi B e 100 U/ml di DNasi 1
    2. Mescolare delicatamente su un agitatore da bilancia per 45 min.
    3. Filtrare le cellule attraverso una maglia di nylon da 30 μm.
  2. Isolare le cellule mononucleate (MNC) a bassa densità mediante centrifugazione su gradiente di densità al Ficoll:
    1. Diluire la sospensione di sangue o di midollo con 2-4 volumi di PBS contenente siero fetale bovino (FBS) al 2% e 2 mM di EDTA. N.B. Volumi più elevati aumentano la purezza delle MNC.
    2. In un tubo conico da 50 ml, stratificare con attenzione 35 ml di sospensione cellulare diluita su 15 ml di Ficoll-paque. Centrifugare a 400g per 30 minuti in un rotore a cestelli oscillanti senza freno.
    3. Aspirare lo strato superiore lasciando inalterato lo strato intermedio di MNC.
    4. Trasferire lo strato di interfase (contenente le MNC) in un nuovo tubo conico da 50 ml.
    5. Aggiungere PBS contenente 2% di FBS e 2 mM di EDTA per riempire questo tubo, mescolare delicatamente capovolgendo il tubo e centrifugare a 300g per 10 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il soprannatante.
    6. Lavare il pellet cellulare altre 2 volte per rimuovere le piastrine. N.B. Questo passaggio aumenta la purezza delle cellule CD34+ cellule
    7. Prelevare 20 μl di sospensione cellulare e trasferirli in una provetta eppendorf. Aggiungere 200 μl di tampone per la lisi dei globuli rossi (Tabella 1) e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti. Posizionare 18 μl di questa sospensione sotto un emocitometro e contare le MNC nucleate.
    8. Le MNC possono essere utilizzate immediatamente o congelate a 108 cellule/ml in mezzo di coltura cellulare contenente il 10% di DMSO e conservate in azoto liquido.
  3. Isolare CD34+ cellule mediante selezione immunomagnetica positiva (Figura 1-Passo 1)
    Utilizziamo il CD34 Microbead Kit (contenente una soluzione di microperle coniugate ad anticorpi monoclonali murini anti-CD34 umano e una soluzione di Reagente Bloccante FcR contenente IgG umana) in combinazione con due colonne LS Mini-MACS, il Running Buffer autoMACS e un separatore MiniMACS (Tabella 1). Di seguito descriviamo il nostro protocollo a partire da 2,3x10⁸8 MNC. Se si utilizzano numeri diversi di cellule, i volumi devono essere adeguati proporzionalmente. Inoltre, per un numero di cellule fino a 2x108 MNCs a MS MiniMacs: una colonna può essere utilizzata al posto della colonna LS MiniMacs.
    Mantenere le cellule e i reagenti al freddo (4-8 °C) per prevenire il capping degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura cellulare non specifica.
    1. Risospendere il pellet contenente 2,3x108 MNC in 690 μl di Running Buffer (300 μl per 108 MNC, dove 300 μl è il volume minimo di sospensione richiesto) e trasferire in un tubo conico da 15 ml.
    2. Aggiungere 230 μl di reagente bloccante FcR
    3. Aggiungere 230 μl di soluzione di CD34 MicroBeads.
    4. Mescolare accuratamente a mano e incubare per 30 min. a 4 °C.
    5. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di Running Buffer e centrifugare a 300g per 10 minuti.
    6. Aspirare completamente il soprannatante.
    7. Risospendere le cellule in 1,2 ml di Running Buffer (utilizzare 0,5 ml di buffer per 108 MNC N.B. È importante ottenere una sospensione di singole cellule prima della separazione magnetica. Se necessario, far passare le cellule attraverso un filtro in nylon da 30 μm per rimuovere gli aggregati cellulari.
    8. Preparare la colonna LS posizionandola nel campo magnetico di un separatore MiniMACS.
    9. Lavare la colonna con 3 ml di Running Buffer.
    10. Applicare 1,2 ml di sospensione cellulare sulla colonna.
    11. Raccogliere il flusso passante e utilizzarlo per verificare il rendimento e la purezza delle cellule CD34+ isolamento cellulare. In alternativa, congelare le cellule contenute in questa frazione e conservarle in azoto liquido. N.B. Questa frazione contiene cellule non marcate e può contenere anche alcune cellule CD34 marcate+ cellule che non si sono attaccate alla colonna.
    12. Lavare la colonna tre volte con 3 ml di Running Buffer, raccogliere i lavaggi in un unico contenitore e utilizzare questa frazione in modo analogo alla frazione di flusso passante descritta in precedenza.
    13. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla su una provetta di raccolta in polipropilene da 15 ml.
    14. Per eluire le cellule, aggiungere 5 ml di Running Buffer sulla colonna ed eluire immediatamente le cellule CD34 marcate+ cellule spingendo con fermezza lo stantuffo nella colonna.
    15. Ripetere la procedura di purificazione su colonna (passaggi da h a n) passando le cellule su una colonna LS appena preparata. N.B. Questo aumenta la purezza delle cellule CD34+ cellule. Da una sospensione di 2,3x108 MNC isolate da leucafiaresi, tipicamente si ottengono 1,1x106 CD34+ cellule con una purezza > 95±3% (Figura 1-Passo 1).
    16. Congelare le cellule nel mezzo di coltura contenente il 10% di DMSO e conservare in azoto liquido oppure procedere direttamente al passaggio 2).

2. Differenziamento eritroide in coltura cellulare

Le cellule CD34+ sono coltivate in mezzo IMDM integrato con un apporto sequenziale di idrocortisone e specifiche combinazioni di citochine, seguendo un protocollo in quattro passaggi adattato da 6 (Figura 1-Passo 2). Durante l'intero procedimento vengono eseguite una serie di analisi per verificare la crescita cellulare e la differenziazione eritoide.

Il numero di cellule CD34+ necessarie per avviare una coltura è variabile e dipende dalla scala dell'esperimento. In genere, per studi sull'espressione genica si effettua una coltura su piccola scala partendo da 0,1x106 cellule CD34+ in 10 ml di mezzo, mantenendo volumi ridotti congelando le cellule in eccesso durante tutta la procedura. Per studi che richiedono l'estrazione di proteine, le colture vengono effettuate su scala più ampia. Di seguito descriviamo un esperimento su larga scala in cui si parte da circa 7x106 cellule CD34+ isolate da leucoaferesi.
Si utilizzano condizioni sterili per tutta la durata dell'esperimento. Per i reagenti, consultare le tabelle 1, 2 e 3.

  1. Preparare i reagenti
    1. Preparare il mezzo IMDM integrato come descritto nella Tabella 2 e congelare aliquote da 40 ml a -20°C (può essere fatto in anticipo).
    2. Preparare soluzioni stock di idrocortisone e citochine come descritto nella Tabella 3.
  2. Passaggio 1: Giorno 0-11
    Le cellule ematopoietiche vengono coltivate in mezzo IMDM integrato contenente idrocortisone (HC), fattore di crescita delle cellule staminali (SCF), interleuchina 3 (IL-3) ed eritropoietina (EPO) (Tabella 3). Le cellule stromali del midollo osseo murino MS-5 (Tabella 1) vengono amplificate in previsione del Passaggio 2.
    • Giorno 0:
      1. Riscaldare preventivamente 120 ml di mezzo IMDM integrato e aggiungere HC, SCF, IL-3 ed EPO (Tabella 3).
      2. Scongelare 7x106 cellule CD34+ ponendo inizialmente il/i flacone/i in un bagno a 37°C. Mentre le cellule sono ancora congelate, aggiungere 1 ml di mezzo preriscaldato e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 ml. Lavare il flacone con 2 ml di mezzo e trasferire nel tubo da 15 ml.
      3. Aggiungere 6 ml di mezzo alla sospensione cellulare, mescolare capovolgendo il tubo e centrifugare a 200 g per 5 min.
      4. Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di mezzo fresco.
      5. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro dopo aver mescolato 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di soluzione di blu di tripano (Tabella 1). NB: La morte cellulare è circa il 25% durante lo scongelamento, quindi la concentrazione di cellule vive dovrebbe essere ~0,5x106 cellule/ml.
      6. Conservare circa 3 ml di sospensione cellulare per analisi (vedi paragrafo 6).
      7. Trasferire i restanti 7 ml in un fiasco T-175 e aggiungere 63 ml di mezzo per ottenere 0,05x106 cellule/ml in 70 ml e posizionare il fiasco in un incubatore a 37°C.
    • Giorno 1:
      1. Riscaldare preventivamente 85 ml di mezzo di coltura per cellule MS-5: αMEM con Glutamax (Tabella 1), 10% FBS e 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina.
      2. Preparare tre piastre rotonde da 150 mm x 25 mm, ciascuna seminata con 2x106 cellule MS-5 in 25 ml di mezzo per ottenere 0,08x106 cellule/ml e posizionarle in un incubatore a 37°C. NB: I migliori risultati si ottengono utilizzando cellule MS-5 a basso passaggio (<20). Le colture confluenti devono essere espanse suddividendole 1:5 ogni tre giorni usando tripsina contenente 0,05% EDTA.
    • Giorno 2:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere le cellule necessarie (es. ~20 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: Nella nostra esperienza, nei primi 2 giorni la morte cellulare può superare il 30-50% e pertanto la concentrazione finale delle cellule di solito è vicina a quella del Giorno 0 (Figura 2).
      2. Sostituire il mezzo di coltura delle cellule MS-5 con 25 ml di mezzo fresco assicurandosi di rimuovere le cellule MS-5 non attaccate.
    • Giorno 4:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere le cellule necessarie (es. ~10 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: A questo punto, le cellule dovrebbero aver iniziato a proliferare con >75% di cellule vitali a una concentrazione di ~0,2x106 cellule/ml. Le cellule possono essere congelate a 1-2x106 cellule/ml in mezzo IMDM integrato contenente 10% DMSO e conservate in azoto liquido.
      2. Trasferire i restanti ~40 ml di coltura in un fiasco T-175 e aggiungere mezzo IMDM integrato contenente HC, SCF, IL-3 ed EPO (Tabella 3) fino a raggiungere un volume finale di 150 ml. NB: La concentrazione cellulare dovrebbe essere ~0,05x106 cellule/ml.
      3. Ampliare le cellule MS-5 (che dovrebbero essere confluenti al 60-70%) diluendole 1:5 in nuove piastre rotonde da 150 mm x 25 mm usando tripsina 0,05% EDTA. La concentrazione cellulare finale dovrebbe essere ~0,08x106 cellule/ml. NB: Di solito, una piastra può essere espansa 5 volte, in modo da ottenere 15 piastre di cellule MS-5 a ~0,08x106 cellule/ml.
    • Giorno 6:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: Le cellule sono in una fase di alta proliferazione e la concentrazione cellulare deve essere mantenuta ≤1,5x106 cellule/ml. Se la concentrazione è superiore, aggiungere mezzo IMDM integrato fresco contenente HC, SCF, IL-3 ed EPO.
    • Giorno 7:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte. NB: Nella nostra esperienza, le cellule di solito raggiungono una densità di 1,5x106 cellule/ml al Giorno 7.
      2. Aggiungere mezzo sufficiente per mantenere una concentrazione cellulare di ~0,8x106 cellule/ml. NB: Di solito aggiungiamo 100 ml di mezzo IMDM integrato fresco contenente HC, SCF, IL-3 ed EPO per ottenere 245 ml di cellule a ~0,8x106 cellule/ml.
      3. Ampliare le cellule MS-5 (che dovrebbero essere confluenti al 60-70%) diluendole 1:5 in fiaschi T-175 (invece che in piastre) usando tripsina 0,05% EDTA. La concentrazione cellulare finale dovrebbe essere ~0,08x106 cellule/ml. NB: Devono essere preparati 61 fiaschi di cellule MS-5 a ~0,08x106 cellule/ml. Congelare le cellule MS-5 rimanenti e conservarle in azoto liquido.
    • Giorno 8:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~1x106 cellule/ml.
      2. Riscaldare preventivamente 2 L di mezzo IMDM integrato contenente solo SCF ed EPO (Tabelle 2 e 3).
      3. Raccogliere 200 ml di coltura ematopoietica (contenente ~200x106 cellule), centrifugare a 200 g per 10 min, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 40 ml di mezzo IMDM integrato contenente SCF ed EPO.
      4. Distribuire la sospensione cellulare in 8 fiaschi T-175 (5 ml per fiasco) e aggiungere 245 ml di mezzo IMDM integrato contenente SCF ed EPO a ciascun fiasco. NB: Ora abbiamo 8 fiaschi, ciascuno contenente 250 ml di cellule a 0,1x106 cellule/ml.
      5. Le cellule rimanenti (~40 ml) al Giorno 8 possono essere congelate a 1-2x106 cellule/ml in mezzo IMDM integrato contenente 10% DMSO e conservate in azoto liquido.
    • Giorno 10:
      1. Contare le cellule ematopoietiche con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~1x106 cellule/ml.
  3. Passaggio 2: Giorno 11-15
    Circa metà delle cellule vengono raccolte per un uso futuro (es. estrazione nucleare). Le restanti cellule eritroidi vengono co-coltivate su cellule MS-5 in mezzo IMDM integrato contenente EPO (Tabelle 2 e 3). Le cellule eritroidi devono essere trasferite su un nuovo strato di MS-5 ogni 3-4 giorni.
    • Giorno 11:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte. NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Riscaldare preventivamente 1 L di PBS 1x, 400 ml di mezzo IMDM integrato e 5 L di mezzo IMDM integrato contenente EPO (Tabelle 2 e 3) a 37°C.
      3. Conservare un volume di coltura equivalente a 15x108 cellule (es. ~4 fiaschi da 250 ml ciascuno) e procedere al punto e.
      4. Le cellule rimanenti (es. 15x108) vengono raccolte in tubi conici, centrifugate a 450 g per 10 min, risospese in tampone MS30 freddo (Tabella 5) contenente 0,1 mM DTT usando un massimo di 108 cellule/ml e conservate a -80°C dopo congelamento rapido in azoto liquido per un uso futuro (es. estratto nucleare).
      5. Lavare 50 fiaschi di cellule MS-5 confluenti con 20 ml di PBS 1x ciascuno e aggiungere immediatamente 80 ml di mezzo IMDM integrato fresco contenente EPO in ciascun fiasco. NB: A causa del gran numero di fiaschi, lavoriamo 4 fiaschi alla volta. Precisamente, recuperiamo 4 fiaschi di cellule MS-5 confluenti dall'incubatore, li laviamo con PBS 1x, aggiungiamo 80 ml di mezzo e rimettiamo i fiaschi in incubatore. Quando tutti i fiaschi sono preparati e rimessi in incubatore, procediamo al punto f. Poiché il numero di fiaschi da trattare in una procedura su larga scala è elevato, è utile che questi passaggi siano eseguiti da due persone che lavorano contemporaneamente.
      6. Centrifugare l'equivalente di 15x108 cellule eritroidi in 4 tubi conici a 450 g per 10 min e scartare il soprannatante.
      7. Lavare i 4 pellet cellulari con 100 ml ciascuno di mezzo IMDM integrato.
      8. Risospendere ciascun pellet cellulare in 250 ml di mezzo IMDM integrato contenente EPO e distribuire 20 ml di questa sospensione cellulare in ciascuno dei 50 fiaschi contenenti cellule MS-5 e 80 ml di mezzo. NB: A questo punto, si dovrebbero avere 50 fiaschi con cellule MS-5 confluenti contenenti 100 ml di cellule eritroidi a 0,3x106 cellule/ml.
      9. Ampliare gli 11 fiaschi rimanenti di cellule MS-5 diluendoli 1:5 in fiaschi T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. La concentrazione cellulare finale dovrebbe essere ~0,08x106 cellule/ml. NB: Devono essere preparati 55 fiaschi di cellule MS-5 a ~0,08x106 cellule/ml.
    • Giorno 12:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~4 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~0,6x106 cellule/ml.
    • Giorno 14:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~3 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~0,9x106 cellule/ml.
  4. Passaggio 3: Giorno 15-18
    Alcune cellule vengono raccolte per un uso futuro (es. estrazione nucleare). Le restanti cellule eritroidi vengono co-coltivate su cellule MS-5 in mezzo IMDM integrato senza citochine.
    • Giorno 15:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte. NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~1x106 cellule/ml.
      2. Riscaldare preventivamente 1 L di PBS 1x e 5 L di mezzo IMDM integrato (Tabella 2) a 37°C.
      3. Conservare un volume di coltura equivalente a 10x108 cellule (es. ~10 fiaschi da 100 ml ciascuno) e procedere al punto e.
      4. Le cellule rimanenti (es. 40x108) vengono raccolte e risospese in tampone MS30 freddo (Tabella 5) contenente 0,1 mM DTT per un uso futuro (vedi Passaggio 2: Giorno 11 punto d).
      5. Lavare 50 fiaschi di cellule MS-5 confluenti con 20 ml di PBS 1x ciascuno e aggiungere immediatamente 80 ml di mezzo IMDM integrato fresco in ciascun fiasco.
      6. Centrifugare l'equivalente di 10x108 cellule eritroidi in 4 tubi conici a 450 g per 10 min e scartare il soprannatante.
      7. Lavare i 4 pellet cellulari con 100 ml ciascuno di mezzo IMDM integrato.
      8. Risospendere ciascun pellet cellulare in 250 ml di mezzo IMDM integrato e distribuire 20 ml di questa sospensione cellulare in ciascuno dei 50 fiaschi contenenti cellule MS-5 e 80 ml di mezzo. NB: A questo punto, si dovrebbero avere 50 fiaschi con cellule MS-5 confluenti contenenti 100 ml di cellule eritroidi a 0,2x106 cellule/ml.
      9. Ampliare i 5 fiaschi rimanenti di cellule MS-5 diluendoli 1:5 in fiaschi T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. La concentrazione cellulare finale dovrebbe essere ~0,08x106 cellule/ml. NB: Devono essere preparati 20 fiaschi di cellule MS-5 a ~0,08x106 cellule/ml. Congelare le cellule MS-5 rimanenti e conservarle in azoto liquido.
    • Giorno 16:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~4 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~0,6x106 cellule/ml.
  5. Passaggio 4: Giorno 18-26
    Le cellule eritroidi vengono concentrate 3-4 volte per ottenere una concentrazione finale di 5-7x106 cellule/ml e mantenute sullo strato di MS-5 per consentire la maturazione. Viene aggiunto il 10% di FBS al mezzo IMDM integrato per consentire una migliore conservazione dei globuli rossi coltivati (cRBCs).
    • Giorno 18:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~2 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare dovrebbe essere ~1,7x106 cellule/ml.
      2. Riscaldare preventivamente 300 ml di PBS 1x e 1,5 L di mezzo IMDM integrato (Tabella 2) contenente 10% FBS a 37°C.
      3. Lavare 15 fiaschi di cellule MS-5 confluenti con 20 ml di PBS 1x ciascuno e aggiungere immediatamente 80 ml di mezzo IMDM integrato fresco in ciascun fiasco.
      4. Centrifugare le cellule eritroidi (es. l'equivalente di 85x108 cellule) a 450 g per 10 min, unire e distribuire il pellet in 4 tubi conici.
      5. Risospendere ciascun pellet cellulare in 75 ml di mezzo IMDM integrato contenente 10% FBS e distribuire 20 ml di questa sospensione cellulare in ciascuno dei 15 fiaschi contenenti cellule MS-5 e 80 ml di mezzo. NB: A questo punto, si dovrebbero avere 15 fiaschi con cellule MS-5 confluenti contenenti 100 ml di cellule eritroidi a 6x106 cellule/ml.
      6. Ampliare i 5 fiaschi rimanenti di cellule MS-5 diluendoli 1:5 in fiaschi T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. La concentrazione cellulare finale dovrebbe essere ~0,08x106 cellule/ml. NB: Devono essere preparati 20 fiaschi di cellule MS-5 a ~0,08x106 cellule/ml. Congelare le cellule MS-5 rimanenti e conservarle in azoto liquido.
    • Giorno 20:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~1,5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare è mantenuta ~1,5x106 cellule/ml.
    • Giorno 22:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~1,5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare è mantenuta ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Cambiare il mezzo e trasferire le cellule eritroidi su nuovi strati di cellule MS-5 come descritto per il Giorno 18.
    • Giorno 24:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~1,5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare è mantenuta ~1,5x106 cellule/ml.
    • Giorno 26:
      1. Contare le cellule eritroidi con blu di tripano per escludere le cellule morte e raccogliere il numero necessario di cellule (es. ~1,5 ml di coltura) per analisi (vedi paragrafo 6). NB: La densità cellulare è mantenuta ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Raccogliere i cRBCs non aderenti, enucleati e completamente emoglobinizzati. NB: I cRBCs maturi possono essere conservati in mezzo SAGM (MacoPharma) a 4°C per un massimo di un mese.
  6. Analisi e risultati rappresentativi
    Le seguenti analisi vengono eseguite nei giorni indicati per verificare una corretta proliferazione cellulare e differenziazione eritroide. I risultati rappresentativi mostrati nelle figure sono stati ottenuti utilizzando cellule CD34+ isolate da leucoaferesi.
    1. Le cellule vengono contate ogni due giorni. Vedere il risultato rappresentativo della proliferazione cellulare nella Figura 2.
    2. La colorazione morfologica May-Grünwald Giemsa viene eseguita ogni due giorni utilizzando 0,05 x106 cellule per i Giorni 0-8 e 0,2x106 cellule per gli altri giorni seguendo le istruzioni del produttore della colorazione Giemsa (Tabella 1). Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 3.
    3. Test in semisolido vengono eseguiti in duplicato per misurare i progenitori ematopoietici ogni due giorni dal Giorno 0 al Giorno 12 utilizzando 0,01x106 cellule per saggio seguendo le istruzioni del produttore del mezzo semisolido Methocult (Tabella 1). Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 4.
    4. L'analisi dei seguenti marcatori cellulari viene eseguita ogni due giorni mediante FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS utilizzando 0,2 x106 cellule per saggio. Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 5.
    5. L'emoglobina viene misurata ogni due giorni mediante colorazione con benzidina. Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 5.
    6. L'espressione genica viene studiata mediante RT-qPCR o microarray dopo estrazione dell'RNA da 1x106 cellule. Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 6B.

Commenti sui risultati:

La Figura 1 illustra il protocollo per la differenziazione ex vivo di cellule umane CD34+ in globuli rossi maturi contenenti emoglobina. Durante la differenziazione eritroide, le cellule sono altamente proliferative, come mostrato dall'amplificazione di circa 8.000 volte riportata nella Figura 2, ottenuta utilizzando cellule CD34+ isolate da leucoaferesi. Le cellule CD34+ isolate dal midollo osseo sono leggermente meno proliferative, con un'amplificazione di circa 6.000 volte, mentre le cellule CD34+ isolate dal sangue del cordone ombelicale possono raggiungere un'amplificazione di 50.000 volte. Le cellule in particolari stadi di differenziazione mostrano dimensioni e morfologie riconoscibili, illustrate nella Figura 3. Si noti il processo di enucleazione che avviene alla fine della differenziazione a partire dal giorno 20. Al giorno 26, tutte le cellule hanno perso il nucleo (Figura 3).

I saggi di formazione di colonie mostrati nella Figura 4 vengono utilizzati per rilevare progenitori ematopoietici precoci e tardivi durante i primi giorni di differenziamento (Giorno 0 al Giorno 8). Oltre ai progenitori eritroidi (CFU-E e BFU-E), osserviamo che i progenitori granulocito-macrofagici (CFU-GM) sono significativamente rappresentati all'interno delle cellule CD34+ precoci al Giorno 0. Procedendo il differenziamento, i CFU-GM diminuiscono notevolmente e al Giorno 6 sono completamente sostituiti dai progenitori eritroidi BFU-E e CFU-E. È inoltre importante notare che dal Giorno 4 al Giorno 6 i progenitori eritroidi precoci BFU-E vengono progressivamente sostituiti dai loro derivati più differenziati, i CFU-E. Al Giorno 10, le cellule eritroidi hanno essenzialmente perso la capacità di formare colonie.

Infine, l'eritropoiesi viene monitorata mediante l'espressione di marcatori di superficie cellulare, come mostrato nella Figura 5. Notare: 1) la progressiva perdita del marcatore di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche CD34; 2) l'acquisizione e successiva perdita progressiva del marcatore progenitore CD36; 3) l'acquisizione e successiva perdita progressiva del marcatore di progenitore eritroide e reticolociti CD71; e 4) l'aumento del marcatore di precursore eritroide ed eritrociti GPA. Altri marcatori di differenziamento eritroide includono la sintesi di emoglobina a partire dal giorno 8 (misurata con la colorazione alla benzidina - Figura 5) e l'enucleazione cellulare a partire dal giorno 20, valutata sulla base della perdita della colorazione del DNA LDS (Figura 5). Infine, il differenziamento eritroide può essere misurato mediante RT-qPCR per marcatori molecolari come il fattore di trascrizione TAL1 (Figura 6B) o i geni della β-globina (dati non mostrati).

Tipicamente, 1 ml di sangue del cordone ombelicale/leucoaferesi/midollo osseo fornisce 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 cellule CD34+, che teoricamente possono produrre 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 globuli rossi con tassi di proliferazione rispettivi di 50.000 / 8.000 / 6.000. Per ottenere 50x106 globuli rossi al termine della procedura di differenziamento, sarà necessario circa 50 ml di mezzo di coltura.

Parte II. Silenziamento mediato da lentivirus durante la differenziazione eritoide ex vivo

Il lentivirus è uno strumento di elezione per il trasferimento genico in cellule primarie umane (si veda ad esempio Amsellem et al. 9). I lentivirus sono spesso utilizzati per ridurre l'espressione di geni di interesse in cellule primarie mediante il trasferimento di shRNA specifici (si veda ad esempio Laurenti et al. 10). In questo protocollo, il fattore di trascrizione TAL1 viene bersagliato in cellule eritroidi primarie umane. Un shRNA con una sequenza casuale che non corrisponde a nessun gene noto viene utilizzato come controllo negativo. L'espressione di GFP viene utilizzata per valutare l'efficienza di trasduzione.

1. Preparazione delle particelle del vettore lentivirale

Per ottenere particelle lentivirali, le cellule renali embrionali umane 293T vengono cotrasfettate con tre plasmidi: uno contenente un sistema di impacchettamento virale di seconda generazione che codifica per i geni dell'HIV-1 ad eccezione di env, vpr, vif, vpu e nef (ovvero psPAX2); uno che codifica per l'involucro del virus pseudotipizzato con la glicoproteina G della stomatite vescicolare (ovvero pMD2G); e un vettore lentivirale che codifica per il gene di interesse (ovvero pBLOCK-it6-DEST(shTal1) che codifica per l'shRNA di TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr) che codifica per uno shRNA casuale o pWPIP che codifica per GFP) (Tabella 4). Le particelle lentivirali vengono raccolte dal sopranatante della coltura cellulare delle cellule 293T trasfettate.

Per evitare infezioni indesiderate delle cellule, eseguiamo tutti gli esperimenti con lentivirus (preparazione dei virus e infezione) all'interno di una cappa dedicata, separata dalle altre colture cellulari. Inoltre, i rifiuti contenenti lentivirus vengono smaltiti separatamente. I lentivirus di seconda generazione descritti in questo protocollo sono incapaci di replicazione e devono essere trattati come organismi di Livello di Sicurezza Biologica 2. Alcune istituzioni potrebbero avere procedure di sicurezza specifiche relative ai lentivirus e raccomandiamo di seguire le linee guida istituzionali stabilite.

Descriviamo qui un protocollo che fornirà un numero sufficiente di particelle lentivirali per infettare da 1 a 2 milioni di cellule eritroidi primarie in qualsiasi stadio di differenziazione. I volumi devono essere adeguati di conseguenza per aumentare o ridurre la scala. Vedere le tabelle 4 e 5 per i reagenti.

  1. Trasfezione di cellule 293T con fosfato di calcio.
    1. Un giorno prima della trasfezione, seminare 13,2 x 106 cellule 293T in 20 ml di mezzo DMEM/glucosio ad alta concentrazione contenente 10% di FBS e Pen/Strep in una piastra da coltura cellulare da 15 cm. NB. Questo permetterà alle cellule di raggiungere una confluenza del 70% nel giorno della trasfezione. I migliori risultati si ottengono utilizzando cellule 293T a basso passaggio (<20).
      Opzionale: le piastre possono essere rivestite con collagene di tipo I o con poli-L-lisina per migliorare l'adesione delle cellule 293T.
    2. Due ore prima della trasfezione, aspirare il mezzo dalle cellule 293T e aggiungere delicatamente 20 ml di mezzo fresco preriscaldato a 37°C. NB: Di solito iniziamo la trasfezione alla fine della giornata.
    3. Mescolare i seguenti reagenti in un tubo da 5 ml:
      • 44,8 μg di vettore di espressione per il gene di interesse (ad es. shRNA o GFP – vedere Tabella 4)
      • 13,35 μg di vettore dell'involucro pMD2.G.
      • 33,48 μg di vettore di impacchettamento psPAX2.
      • Aggiungere acqua sterile in quantità sufficiente per portare il volume a 1,116 ml.
    4. Aggiungere acqua sterile in quantità sufficiente per portare il volume a 1,116 ml.
    5. Aggiungere 109,8 μl di CaCl2 2,5 M e vortexare per mescolare.
    6. In un tubo conico da 50 ml, aggiungere 1,116 ml di tampone 2xHBS (Tabella 5).
    7. Aggiungere, sotto costante agitazione con vortex, la miscela di DNA goccia a goccia nel tampone 2xHBS.
    8. Lasciare formare il precipitato a temperatura ambiente per 20 min (non più di 30 min).
    9. Aggiungere la soluzione da 2,3 ml goccia a goccia alla piastra contenente le cellule 293T, agitare delicatamente e trasferire le cellule in un incubatore a 37°C per 12-14 ore.
    10. La mattina seguente, aspirare il mezzo e sostituirlo con 20 ml di mezzo fresco preriscaldato a 37°C.
  2. Raccolta e concentrazione del lentivirus
    1. Quarantotto ore dopo la trasfezione, raccogliere 20 ml di mezzo contenente il lentivirus e trasferirli in un tubo conico da 50 ml.
    2. Aggiungere 20 ml di mezzo preriscaldato a 37°C alle cellule 293T e reinserirle nell'incubatore.
    3. Centrifugare il sopranatante virale a 450 g per 10 min per rimuovere eventuali detriti cellulari e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 ml. In alternativa, il sopranatante può essere filtrato attraverso un filtro da 0,45 μm. Conservare il sopranatante chiarificato a 4°C.
    4. Ventiquattro ore dopo, raccogliere i restanti 20 ml di mezzo. NB: Riscontriamo che i titoli virali sono approssimativamente equivalenti in entrambe le raccolte, cioè 1x 106 UT/ml.
    5. Per concentrare i virus, i sopranatanti virali vengono distribuiti in tubi Beckman OptiSeal (utilizzando 32,4 ml di sopranatante per tubo) e centrifugati a 100.000 g per 1,5 h a 4°C utilizzando un rotore oscillante. N.B. Metodi alternativi per concentrare il sopranatante virale includono la centrifugazione a 47.000 g per 2 h o a 3.000 g per 8 h. Non congelare il virus prima della concentrazione. Il congelamento provoca la precipitazione delle proteine, rendendo difficile la risospensione del virus.
    6. Immediatamente dopo l'ultracentrifugazione, aspirare lentamente il sopranatante utilizzando una pipetta di plastica da 10 ml e scartarlo. NB: Fare attenzione a non disturbare il pellet, che può staccarsi facilmente dal tubo. Dopo aver scartato i primi 5 ml di sopranatante, di solito tagliamo la parte superiore del tubo dell'ultracentrifuga per facilitare la rimozione del maggior quantitativo possibile di sopranatante, lasciandone circa 100-200 μl sul fondo del tubo.
    7. Aggiungere 100 μl di PBS 1x, lasciare sciogliere il pellet a temperatura ambiente per 30 min e risospendere aspirando e rilasciando 15-20 volte con la pipetta. NB: Tipicamente, otteniamo circa 200-300 μl di virus concentrato.
    8. La preparazione di lentivirus concentrato viene titolata su cellule NIH3T3 utilizzando un protocollo di Invitrogen (Sistema Block-it per espressione di RNAi virale lentivirale). NB: Otteniamo tipicamente titoli virali compresi tra 2 e 10x108 unità trasducenti (UT)/ml.
    9. Il virus può ora essere utilizzato per l'infezione (vedi paragrafo 2) oppure frazionato e conservato a -80°C fino a 6 mesi. NB: Evitare di sottoporre le sospensioni virali a più di un ciclo di congelamento-scongelamento. I virus sono stabili per 4-5 h a 37°C, 2-3 giorni a temperatura ambiente o una settimana a 4°C.

2. Infezione lentivirale di cellule eritroidi primarie per il trasferimento genico

  1. Infezione
    Le cellule eritroidi nucleate possono essere infettate in modo efficiente in qualsiasi stadio di differenziazione, purché venga utilizzato un alto MOI (multiplicità di infezione) compreso tra 50 e 100. Di seguito descriviamo un esperimento tipico in cui lentivirus esprimenti un shRNA contro TAL1 o uno shRNA di controllo casuale (scramble) vengono utilizzati per infettare cellule eritroidi ai giorni 8 e 9 di differenziazione, usando un MOI di 50 TU/cellula. L'RNA viene estratto ogni 24 ore per verificare il livello di silenziamento di TAL1 mediante RT-qPCR. L'espressione di GFP viene misurata in parallelo mediante FACS per valutare l'efficienza di infezione (vedi risultati rappresentativi nella Figura 6).
    • Giorno 0:
      1. Preparare tre provette coniche da 15 ml contenenti ciascuna 1x106 cellule eritroidi (ovvero una provetta per il silenziamento di TAL1, una per il controllo negativo casuale e una per il controllo dell'espressione di GFP).
      2. Lavare le cellule con 5 ml di mezzo IMDM supplementato contenente SCF ed EPO (vedi Parte I), centrifugare a 200 g per 5 minuti ed eliminare il più possibile il soprannatante.
      3. Aggiungere polibrene (Tabella 4) a una concentrazione finale di 40 μg/ml nella soluzione virale concentrata.
      4. Aggiungere 100 μl di virus concentrato (ovvero 5x107 TU) contenente polibrene a ciascuna provetta con cellule eritroidi.
      5. Incubare per 1 ora nell'incubatrice a 37°C, mescolando ogni 10 minuti con leggeri colpetti con le dita. N.B. l'infezione deve essere eseguita con volumi minimi di mezzo per consentire un'adsorbimento massimo del lentivirus sulle cellule. Inoltre, il mescolamento ogni 10 minuti favorisce una distribuzione uniforme del virus tra le cellule.
      6. Aggiungere 900 μl di mezzo IMDM supplementato contenente SCF ed EPO (Tabelle 2 e 3) in ciascuna provetta.
      7. Trasferire ciascun campione in una piastra a 6 pozzetti e posizionarlo nell'incubatrice a 37°C per 24 ore.
    • Giorno 1: Raccogliere le cellule in provette da 15 ml separate, centrifugarle a 200 g per 5 minuti, rimuovere il soprannatante e ripetere l'infezione (passaggi da b a g riportati sopra).
    • Giorno 2: Lavare le cellule e risospendere a 0,2x106 cellule/ml in mezzo IMDM supplementato contenente SCF ed EPO, quindi procedere come descritto nella Parte I.
  2. Risultati rappresentativi
    La Figura 6A illustra il protocollo di infezione di cellule eritroidi primarie con lentivirus seguito dall'estrazione di RNA. In un esperimento, abbiamo infettato cellule eritroidi con lentivirus che esprimono uno shRNA diretto contro il fattore di trascrizione TAL1 o uno shRNA di controllo casuale 11. La Figura 6B mostra che siamo riusciti a ridurre del 75% i trascritti di TAL1 in cellule eritroidi primarie. Si noti inoltre l'aumento del livello di trascritto di TAL1 dal giorno 9 al giorno 12 nel controllo casuale, a sottolineare l'importanza di questo fattore di trascrizione durante la differenziazione eritoide. In un altro esperimento, abbiamo infettato cellule eritroidi con lentivirus esprimenti la proteina GFP. La Figura 6C mostra che tre giorni dopo l'infezione, la maggior parte delle cellule eritroidi (87%) esprime GFP, come misurato mediante fluorescenza al microscopio e mediante FACS. Ciò indica un'elevata efficienza di infezione nelle cellule eritroidi primarie. In precedenza, abbiamo infettato cellule CD34+ al giorno 0 con un'efficienza simile (dati non mostrati). Il parametro più importante per una trasduzione efficiente delle cellule primarie è l'utilizzo di un alto MOI (ovvero lentivirus concentrati). Se viene utilizzato un basso MOI (ovvero virus non concentrato), l'efficienza di trasduzione diminuirà.

3. Risultati rappresentativi

Diagramma di isolamento positivo di CSE CD34+; separazione immunomagnetica, differenziazione eritroide in assenza di siero.
Figura 1. Schema del protocollo per l'isolamento e la differenziazione eritoide ex vivo di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche primarie umane. (Passaggio 1) Le cellule CD34+ (purezza del 95 ± 3%) vengono isolate da sangue del cordone, midollo osseo o sangue periferico umano mobilizzato con G-CSF (leucoaferesi) mediante selezione immunomagnetica positiva. (Passaggio 2) Le cellule CD34+ vengono coltivate in coltura liquida seguendo il protocollo in quattro passaggi indicato.

Grafico di amplificazione cellulare; scala logaritmica; giorni di coltura rispetto all'analisi dell'andamento della crescita cellulare.
Figura 2. Amplificazione cellulare durante il protocollo di differenziamento eritroide ex vivo. I risultati sono riportati in scala logaritmica. Risultati rappresentativi ottenuti con cellule CD34+ isolate da leucoaferesi.

Grafico delle fasi dell'eritropoiesi, immagini al microscopio che mostrano lo sviluppo dei globuli rossi nel corso di 26 giorni.
Figura 3. Analisi della morfologia cellulare durante la differenziazione eritroide ex vivo. Le cellule sono colorate con il reagente di May-Grünwald-Giemsa nei diversi punti temporali indicati durante la differenziazione (ingrandimento × 40). HSC: cellule staminali/progenitrici ematopoietiche; BFU-E: unità formanti burst – eritroidi; CFU-E: unità formanti colonie – eritroidi; Pro EB: proeritroblasti; Baso EB: eritroblasti basofili; Poly EB: eritroblasti policromatofili; Ortho EB: eritroblasti ortocromatici; RET: reticolociti; RBC: globuli rossi.

Grafico del saggio semisolido; crescita di progenitori CFU-GM, BFU-E, CFU-E; giorni di coltura cellulare; confronto tra immagini.
Figura 4. Saggi di cellule formanti colonie (CFC) per rilevare e quantificare progenitori ematopoietici. Nei tempi indicati, 104 cellule sono state seminate in un mezzo semisolido a base di metilcellulosa in presenza di citochine umane ricombinanti: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO, per favorire la crescita ottimale di progenitori eritroidi (BFU-E e CFU-E) e di progenitori granulociti-macrofagi (CFU-GM). BFU: unità formanti burst; CFU: unità formanti colonie. Nell'immagine sono riportati anche esempi tipici di BFU-E e CFU-E. Si noti il colore rosso-bruno dovuto all'emoglobinizzazione di BFU-E e CFU-E.

Grafici di differenziamento ematopoietico che mostrano i marcatori cellulari CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidina, LDS nel tempo.
Figura 5. Cinetiche dei marcatori ematopoietici/eritroidi durante il differenziamento eritroide ex vivo. Nei punti temporali indicati, sono state raccolte 2x105 cellule e analizzate per l'espressione dei marcatori indicati mediante FACS (CD34, CD36, CD71, GPA e LDS) o mediante microscopia (Benzidina). Le barre rappresentano le percentuali di cellule positive. CD34: glicoproteina transmembrana, presente sulle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane; CD36: recettore della trombospondina, presente sulle cellule progenitrici; CD71: recettore della transferrina, presente sui progenitori eritroidi e sulle reticolociti; GPA: glicoforina A, presente sui precursori eritroidi e sui globuli rossi; Benzidina: colorante per l'emoglobina; LDS: colorante laser styryl, colorante per il DNA.

Linea temporale dell'infezione con lentivirus shRNA, grafico a barre dell'espressione dell'mRNA di TAL1, microscopia GFP, citometria a flusso.
Figura 6. Trasferimento genico mediato da lentivirus in proeritroblasti primari umani. (A) Linea temporale per l'induzione del silenziamento genico di TAL1 (KD) in proeritroblasti primari mediante sistema di consegna genica a base di lentivirus. (B) Il silenziamento di TAL1 è stato mediato da shRNA anti-Tal1 veicolato da lentivirus (TAL1 KD) o da uno shRNA di controllo randomizzato (Scr). La cinetica dei livelli di trascritto mRNA di TAL1 è stata misurata mediante RT-qPCR. L'espressione del trascritto di TAL1 è riportata rispetto all'RNA 18S. (C) L'espressione di GFP veicolata da lentivirus è stata verificata mediante microscopia (pannello sinistro) o FACS (pannello destro). L'87% delle cellule risultava positivo per GFP.

4. Materiali

ReagenteFonteNumero di catalogo
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagenasi BRoche Applied Science11088807001
DNasi ISigmaD5025-15KU
Filtri pre-separazione (maglia di nylon 30μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Buffer di lisi dei globuli rossiStemCell Technologies20120
Kit CD34 MicroBeadMiltenyi Biotec Inc130-046-703
Colonne LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Buffer di esecuzione autoMACS - Buffer di separazione MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Separatore MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Cellule stromali del midollo osseo di topo MS-5 (testate regolarmente per contaminazione da micoplasma)DSMZACC 441
Soluzione di Blu di Tripano (0,4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Tripsina 0,05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Saggi Methocult per cellule formanti colonie (CFC) per cellule umane StemCell Technologies 04044

Tabella 1.

ComponenteSoluzione madreVolume 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786 ml
L-glutammina 4x10-3M200 mM (Gibco 25030)12 ml
Inositolo 40 μg/ml4 mg/ml (Sigma I5125)
preparazione: Sciogliere 28 mg di polvere in 7 ml di IMDM e filtrare per sterilizzare; stabile per 1 settimana a 4 °C.		6 ml
Acido folico 10 μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
preparazione: Sciogliere 7 mg di polvere in 7 ml di IMDM preriscaldato e filtrare per sterilizzare; stabile per 1 settimana a 4 °C. Preriscaldare prima dell'uso.		6 ml
Monotio-glicerolo 1,6x10-4M0,16 M (Sigma M6145)
preparazione: Sciogliere 10 μl di soluzione madre 11,56 M in 712 μl di IMDM e filtrare per sterilizzare; stabile per 1 settimana a 4 °C.		0,6 ml
Nitrato ferroso 90 ng/ml18 μg/ml (Sigma 8508)
preparazione: Sciogliere 1,8 mg in 1 ml di acqua distillata. Prelevare 0,1 ml, aggiungere 9,9 ml di IMDM e filtrare per sterilizzare; stabile per 1 settimana a 4 °C.		3 ml
Solfato ferroso 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
preparazione: Sciogliere 18 mg in 1 ml di acqua distillata. Prelevare 0,1 ml, aggiungere 9,9 ml di IMDM e filtrare per sterilizzare; stabile per 1 settimana a 4 °C.		3 ml
Albumina sierica bovina-Insulina-Transferrina (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabella 2.

ComponenteSoluzione madreVolume da aggiungere a 100 ml di IMDM supplementato (Tabella 2)
Idrocortisone (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
preparazione: Sciogliere 5 mg di polvere in 1,03 ml di IMDM. Prelevare 0,1 ml, aggiungere 9,9 ml di IMDM e filtrare per sterilizzare. Stabile per 1 settimana a 4°C.		1 ml
Fattore di crescita delle cellule staminali (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
preparazione: Sciogliere 50 μg di polvere in 500 μl di PBS+0,1% BSA e filtrare per sterilizzare. Preparare aliquote da 100 μl e conservare a -20°C.		100 μl
Eritropoietina (EPO) 3 UI/ml100 μg/ml equivalente a 12.000 UI/ml (Feldan FB03-10-290)
preparazione: Sciogliere 50 μg di polvere in 500 ml di PBS+0,1% BSA e filtrare per sterilizzare. Preparare aliquote da 25 ml e conservare a -20°C.		25 μl
Interleuchina 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
preparazione: Sciogliere 10 μg di polvere in 100 μl di PBS+0,1% BSA e filtrare per sterilizzare. Preparare aliquote da 5 ml e conservare a -20°C.		5 μl

Tabella 3.

ReagenteFonteRiferimento
Cellule 293T
(testare regolarmente per contaminazione da micoplasma) 		ATCCCRL-11268
DMEM/Glucosio ad alta concentrazioneThermoScientificSH30243.01
Bromuro di esadimetrina (Polybrene)SigmaH9268-5G
Provette per ultracentrifugazione OptiSealBeckman Coulter361625
Plasmide psPAX2Addgene (laboratorio D. Trono)12260
Plasmide pMD2.GAddgene (laboratorio D. Trono)12259
Plasmide pBLOCK-it6-DEST (shTal1)Sequenza di shRNA anti-Tal1 clonata nel plasmide pBLOCK-it6-DEST di InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmide pBLOCK-it6-DEST (shScr)Sequenza di shRNA casuale clonata nel plasmide pBLOCK-it6-DEST di InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmide pWPIAddgene (laboratorio D. Trono)12254

Tabella 4.

TamponePreparazioneConcentrazione finale
2xHBS
  • 1,6 g di NaCl
  • 1,3 g di HEPES
  • 0,04 g di Na2HPO4(7H2O)
  • Aggiungere acqua Milli-Q.
  • Regolare il pH esattamente a 7,11-7,13 aggiungendo soluzione di NaOH e portare ad un volume finale di 100 ml con acqua Milli-Q.
  • Perfezionare il pH a 7,11-7,13.
  • Filtrare per sterilizzare, dividere in aliquote da 10 ml e conservare a -20°C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1,5 mM
CaCl2
  • 2,77 g di CaCl2 anidro
  • Sciogliere in 10 ml di acqua Milli-Q.
  • Filtrare per sterilizzare, dividere in aliquote da 1 ml e conservare a -20°C
  • 2,5 M
MS30
  • 25 ml di Tris [2 M] pH 8,0
  • 5 ml di EDTA [0,5 M]
  • 300 ml di glicerolo
  • 50 mM
  • 2,5 mM
  • 30% (v/v)

Tabella 5.

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Discussione

Un certo numero di metodi sono stati utilizzati in precedenza per differenziare le cellule eritroidi in coltura con gradi variabili di successo. Per esempio, alcuni protocolli senza co-coltura su MS-5 consente l'espansione delle cellule eritroidi, ma non sono efficienti nella produzione di celle enucleato completamente maturo rosso sangue 12-17. Mentre gli altri metodi permettono l'enucleazione efficiente, è a scapito della proliferazione 18,19. Il metodo che abbiamo utilizzato qui, inizial...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo L. Douay e MC Giarratana (Université Paris VI, France) per un parere sulla differenziazione ex vivo eritroide, Allan D. e H. Atkins (Ohří, Canada) per aver fornito campioni di sangue (ottenuto con l'Ospedale di Ottawa di Ricerca Etica consiglio # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne), per fornire i vettori lentivirali e FJ Dilworth (Ohří, Canada) per la lettura critica del manoscritto. Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione CIHR (MOP-82813) a MBCGP è un destinatario di una borsa di studio di ricerca di formazione Ontario computazionale Regulomics Fondo di post-dottorato. MB detiene il Canada Research Chair in Regolazione dell'espressione genica.

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Riferimenti

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