Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Sommario

Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l'utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.

Abstract

Staminali tumorali e studi di biologia cellulare spesso richiedono trasduzione virale delle cellule umane con oncogeni noti o sospetti, sollevando problemi di sicurezza maggiori per il personale di laboratorio. Lentivirus Pantropic, come comunemente utilizzati VSV-G pseudotype, sono uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene perché possono trasdurre molti tipi di cellule, comprese le cellule non si dividono. Tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione e la centrifugazione di virus oncogeni pantropic codifica per esigenze di più alto livello la gestione di biosicurezza e le questioni di sicurezza. Diversi oncogeni potenti, tra cui c-Myc e SV40 T antigene di grandi dimensioni, sono noti per aumentare la produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC). Tutti gli altri noti cambiamenti genetici che inducono IPSC (Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, LIN28, e la perdita della funzione di p53) hanno anche i link al cancro, che li rende di preoccupazione per la sicurezza relativamente elevata.

Anche se questi tumori correlati virus sono utili per studiare la riprogrammazione cellulare e pluripotenza, devono essere usati in modo sicuro. Per affrontare questi problemi di biosicurezza, abbiamo dimostrato un metodo per la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropic, con enfasi sulla riduzione dei costi e gestione conveniente. Abbiamo prodotto lentivirus ecotropic con titolo sufficientemente elevato per trasdurre superiore al 90% del esprimono i recettori delle cellule umane esposte al virus, convalidando l'efficacia di questo approccio.

Lentivirus è spesso concentrata per ultracentrifugazione, tuttavia, questo processo richiede diverse ore e può produrre aerosol infettivi a uomo ricercatori biomedici. In alternativa, le particelle virali possono essere più sicuro sedimentano sulla cellule per complessazione con solfato di condroitina e polibrene (CS / PB). Questa tecnica aumenta il titolo funzionale virale fino a 3 volte nelle cellule che esprimono stabilmente recettore retrovirus murino, con trascurabili tempo aggiunto e costo. Trasduzione di fibroblasti cutanei umani (HDFS) è al massimo migliorata utilizzando CS / PB concentrazioni di circa 4 volte inferiore al valore ottimale riportato in precedenza per le linee di cellule tumorali, suggerendo che la concentrazione polimero deve essere titolato per il tipo di destinazione delle cellule di interesse. Abbiamo quindi descritto l'uso di methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) al dosaggio per la tossicità dei polimeri in un nuovo tipo di cellula. Osserviamo vitalità equivalente di HDFS dopo trasduzione virale utilizzando complessazione polimero o la dose standard di polibrene (PB, 6 mg / ml), con l'indicazione minima tossicità acuta.

In questo protocollo, si descrive l'utilizzo di lentivirus ecotropic per la sovraespressione di oncogeni nelle cellule umane, riducendo i rischi di biosicurezza e l'aumento del tasso di trasduzione. Abbiamo anche dimostrare l'uso di complessazione polimero per migliorare la trasduzione, evitando di aerosol centrifugazione formazione di particelle virali.

Protocollo

1. Produzione, raccolta e congelamento del lentivirus

1. Consultare l'addetto alla sicurezza istituzionale prima di iniziare questo protocollo e seguire le linee guida sulla sicurezza da lui raccomandate.
2. Giorno 1. Iniziare con cellule 293T sane e in rapida crescita per produrre il virus. Seminare le cellule a 5 x 10⁶ cellule per piastra da 10 cm. Utilizzare mezzo per cellule 293T senza antibiotici (DMEM ad alto contenuto di glucosio con 10% di FBS e 4 mM di L-glutammina) per la produzione del virus.
3. Giorno 2. Nel tardo pomeriggio, trasfettare le cellule 293T come segue (i valori indicati si riferiscono a una singola piastra da 10 cm). Lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente. Pipettare 375 μl di OptiMEM in una provetta da microcentrifuga, quindi aggiungere 25 μl di Fugene HD. Evitare che il Fugene non diluito entri in contatto con la superficie della provetta.
4. In una provetta da microcentrifuga, mescolare:
   • 5 μg di plasmide trasferibile (Slc7a1, vettore bersaglio o vettore di controllo fluorescente)
   • 3,75 μg di plasmide di impacchettamento (pCMV-dR8.91 o psPax2)
   • 1,25 μg di plasmide dell'involucro (pMD2.G per tropismo pantropico, pHCMV-EcoEnv per tropismo ecotropico)
   • OptiMEM senza siero fino a un volume finale di 100 μl
5. Unire i contenuti delle due provette e incubare la miscela per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
6. Cambiare il mezzo sulle cellule 293T con 10 ml di mezzo fresco senza antibiotici. Aggiungere la miscela di Fugene/plasmidi goccia a goccia sulla piastra e incubare tutta la notte a 37°C, 5% CO₂.
7. Giorno 3. Cambiare il mezzo sulle cellule 293T con 10 ml di mezzo fresco senza antibiotici. Procedere con delicatezza, poiché le cellule 293T aderiscono in modo debole e possono staccarsi se il mezzo viene pipettato con troppa forza sul monostrato. Incubare per due giorni in un'incubatrice umidificata per la produzione del virus.
8. Giorno 5. Raccogliere il virus e filtrarlo attraverso un filtro con bassa capacità di legame alle proteine da 0,45 mm. Utilizzarlo immediatamente oppure suddividerlo in aliquote monouso e congelarlo a -80°C. Il virus pantropico e il virus ecotropico congelati devono essere rititolati dopo sei mesi e un mese di conservazione, rispettivamente.
9. Titolare il virus come segue, utilizzando cellule relativamente suscettibili alla trasduzione. Trasdurre le cellule con il virus di controllo fluorescente durante la notte usando diluizioni seriali (ad esempio 1:10, 1:100, 1:1000) in mezzo fresco con 6 μg/ml di PB. Il giorno successivo, sostituire con mezzo fresco. Attendere due giorni dopo la trasduzione affinché le cellule inizino a esprimere la proteina fluorescente, quindi determinare la frazione di cellule trasdotte mediante FACS. Calcolare la titolazione in unità trasformanti (TU) per ml, basandosi sulle diluizioni che producono < 15% di trasduzione per minimizzare eventi di trasduzione multipla.
   

2. Trasduzione di cellule bersaglio umane con il recettore del retrovirus murino Slc7a1

1. Selezionare una multiplicità di infezione (MOI) = 2 per garantire che la maggior parte delle cellule venga transdotta. Per cellule bersaglio resistenti alla transduzione, come gli HDF, sarà necessaria una MOI più elevata; noi diluiamo il supernatante virale solo 1:2 per ottenere la transduzione della maggioranza delle cellule.
2. Transdurre le cellule bersaglio durante la notte con il supernatante virale diluito in mezzo di coltura fresco contenente 6 μg/ml di PB, che aumenta la transduzione potenziando l'interazione elettrostatica tra il virus e la cellula bersaglio.¹ Idealmente, si dovrebbe utilizzare un volume minimo di virus, ad esempio 1 ml per una piastra da 35 mm, poiché la diffusione rappresenta un fattore limitante per l'efficienza di transduzione.
3. Coltivare le cellule per almeno 48 ore dopo la rimozione del virus prima di transdurle con virus ecotropo, al fine di assicurare un'espressione sufficiente del recettore Slc7a1.
4. (Facoltativo) È possibile utilizzare la blasticidina per selezionare le cellule transdotte stabilmente che esprimono Slc7a1, se desiderato. Dovrebbe essere generata in anticipo una curva di morte con blasticidina per determinare la concentrazione efficace più bassa, generalmente compresa tra 2 e 10 μg/ml, che uccida tutte le cellule bersaglio non transdotte entro 7 giorni. Circa 2 giorni dopo la rimozione del virus Slc7a1, passare le cellule transdotte a un mezzo contenente blasticidina. Coltivare le cellule in mezzo contenente blasticidina per 7 giorni, al termine dei quali tutte le cellule rimanenti esprimeranno stabilmente il recettore del retrovirus e potranno quindi essere transdotte con virus ecotropo, oltre a essere conservate per utilizzi futuri come linea stabile esprimente Slc7a1.

3. Titolazione del complesso polimerico per determinare la tossicità

1. Giorno 1. Seminare le cellule a 5000 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, prevedendo almeno tre pozzetti replicati per ogni gruppo sperimentale. Includere cellule non transdotte in mezzo completo per fornire un valore di base per cellule sane, nonché campioni costituiti da cellule in mezzo privo di siero per indurre l'arresto della crescita come controllo. Parallelamente, seminare le cellule in un formato appropriato (ad esempio una piastra a 24 pozzetti) per l'analisi microscopica o mediante FACS dell'efficienza di transduzione in ciascuna condizione sperimentale.
2. Giorno 2. Transdurre le cellule nelle piastre preparate sia per l'analisi MTT che per quella mediante FACS con un virus codificante per GFP, a un MOI di 0,5 per transdurre circa il 40% delle cellule bersaglio. Testare diverse concentrazioni di CS/PB (ad esempio 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg/ml di ciascun componente), nonché 6 μg/ml di PB, per determinare le quantità ottimali. Generare i complessi polimerici come descritto nella Parte 4 riportata di seguito.
3. Giorno 3. Rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con mezzo fresco. Reintrodurre le piastre in un incubatore umidificato.
4. Giorno 5. Analizzare la piastra mediante FACS per determinare l'efficienza di transduzione con ciascuna concentrazione polimerica.
5. Giorno 6. Rimuovere il mezzo da tutti i pozzetti della piastra MTT e sostituirlo con 100 μl di soluzione MTT (1 mg/ml di MTT in mezzo completo). Incubare per tre ore in un incubatore umidificato per consentire la riduzione del MTT nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive.
6. Rimuovere la soluzione MTT e sostituirla con 200 ml di solvente per MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanolo).
7. Incubare per due ore a temperatura ambiente o fino a quando tutto il precipitato viola di formazano MTT è completamente disciolto. Leggere l'assorbanza con un lettore per micropiastre a 570 nm, sottraendo il valore di fondo rilevato a 690 nm.
8. Selezionare la concentrazione ottimale di polimero che determina il massimo incremento della transduzione, come stabilito mediante FACS, con effetto minimo sull'attività metabolica, come determinato mediante MTT. Per le HDF, abbiamo selezionato 100 μg/ml di CS/PB in base ai dati mostrati nei Risultati Rappresentativi riportati di seguito.

4. Trasduzione ecotropa con complessazione polimerica

1. Preparare soluzioni stock di PB e solfato di condroitina, filtrate in modo sterile, a 20 mg/ml in acqua. Aliquotare e conservare a -20°C.
2. Trasferire il supernatante virale in una provetta da microcentrifuga e diluirlo alla concentrazione finale desiderata (ad esempio MOI di 2) con mezzo di coltura fresco. Aggiungere successivamente volumi uguali di PB e solfato di condroitina (concentrazioni determinate al punto 3 sopra), agitando leggermente la provetta dopo ogni aggiunta per favorire il mescolamento. La miscela virale diventerà immediatamente torbida con la formazione di precipitati. Incubare la miscela virale a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la formazione dei complessi.
3. Rimuovere il mezzo dalle cellule bersaglio che esprimono il recettore, sostituirlo con la miscela virale e incubare tutta la notte a 37°C, 5% CO2. Dopo aver rimosso la miscela virale, lavare la superficie delle cellule due volte con PBS per facilitare l'eliminazione dei complessi virali. Non è necessaria una rimozione completa; non abbiamo osservato effetti avversi sulla vitalità cellulare dovuti alla presenza di complessi polimerici residui.

5. Verifica della specificità della trasduzione ecotropica

1. Quando si produce per la prima volta un virus ecotropico, è prudente, per motivi di sicurezza, verificare che il virus non sia in grado di trasdurre cellule umane non modificate. Trasdurre le cellule umane con lentivirus ecotropico a concentrazione relativamente elevata (solo un’1-2 volte diluizione del supernatante virale nel mezzo fresco) durante la notte con 6 μg/ml PB o con la concentrazione ottimizzata di CS/PB.
2. Rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con mezzo fresco. Dopo aver incubato le cellule per 2 giorni, verificare l’espressione del transgene mediante FACS utilizzando vettori fluorescenti e/o mediante RT-PCR con primer specifici per il transgene.

6. Risultati rappresentativi:

La Figura 1A mostra il processo di produzione del lentivirus, e la Figura 1B illustra la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropico, inclusa la pre-trasduzione con il recettore del retrovirus murino Slc7a1. Per la titolazione del virus, utilizziamo una linea cellulare di rabdomiosarcoma umano stabilmente trasdotta con Slc7a1 (Slc-hRMS). Quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza di trasduzione, otteniamo regolarmente > Efficienza di trasduzione del 90% di Slc-hRMS con virus ecotropico, come mostrato nelle Figure 2A e 2B. I tassi di trasduzione dei HDF sono generalmente più bassi poiché le cellule non sono state selezionate con blasticidina per l'espressione del recettore (Figura 2C). I titoli del lentivirus ecotropico sono generalmente il 10-20% di quelli del virus pseudotipizzato con VSV quando misurati su Slc-hRMS (Figura 2D).

Un ciclo di congelamento-scongelamento riduce il titolo del virus ecotropo del 16 - 3%, pari alla perdita di titolo osservata durante un singolo ciclo di congelamento-scongelamento del virus pseudotipizzato con VSV (p > 0,05). Contrariamente a quanto riportato in precedenti studi,² non osserviamo alcun effetto positivo sul titolo virale dovuto al congelamento rapido in ghiaccio secco. Al contrario, otteniamo titoli post-scongelamento più elevati per entrambi i pseudotipi semplicemente posizionando le provette del virus in un congelatore a -80°C (dati non mostrati).

Il saggio di vitalità MTT consente una rilevazione sensibile dell'arresto della crescita nelle cellule bersaglio. La trasduzione con il virus più concentrazioni di CS/PB fino a 800 μg/ml non ha alcun effetto sul metabolismo dei fibroblasti dermici umani (HDF) (Fig. 3A). L'esposizione a CS/PB senza virus non ha neppure alcun effetto tossico sulle cellule (dati non mostrati). L'analisi FACS degli HDF trasdotti con il virus e diverse concentrazioni di CS/PB mostra un potenziamento della trasduzione rispetto al PB da solo (Fig. 3B). Il massimo potenziamento si verifica a 100 μg/ml di CS/PB (Fig. 3C), di un valore inferiore di diversi ordini di grandezza rispetto ai valori precedentemente riportati.³ Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per ogni specifico tipo cellulare bersaglio.

La complessazione con CS/PB aumenta di circa 3 volte il titolo osservato in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0,01). In pratica, questo determina un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate (Fig. 4B), il che è molto probabilmente dovuto a cellule trasdotte in modo multiplo e alla saturazione dei recettori a concentrazioni elevate di virus.

La trasduzione con virus ecotropico è specifica per le cellule che esprimono il recettore per retrovirus murino. Quando si effettua la trasduzione di cellule umane non modificate con virus ecotropico, non abbiamo osservato fluorescenza superiore al fondo delle cellule non trasdotte, sia utilizzando PB che CS/PB, come mostrato nella Figura 5A. Microscopicamente, le HDF non mostrano alcuna trasduzione in assenza del recettore (Figura 5B), mentre la pre-trasduzione con il recettore determina la comparsa di cellule fluorescenti (Figura 5C).

Figura 1. Vista schematica di (A) il processo di produzione del virus e di (B) la trasduzione di cellule umane con recettore retrovirale murino seguita da lentivirus ecotropico.

Figura 2. Trasduzione ad alta efficienza di cellule umane con lentivirus ecotropico che codifica per GFP. Le cellule sono state pre-trasdotte con il recettore per retrovirus murino Slc7a1. (A) Linea cellulare di rabdomiosarcoma umano selezionata con blasticidina per Slc7a1 (Slc-hRMS), trasdotta (blu) o non trasdotta (rosa) con GFP. (B) Microfotografia in fluorescenza di Slc-hRMS trasdotte con virus ecotropico (4X). (C) HDF trasdotte (blu) e non trasdotte (rosa) con lentivirus ecotropico GFP; le cellule sono state trasdotte con Slc7a1 due giorni prima della trasduzione ecotropica. (D) Titolo del lentivirus pseudotipizzato con VSV-G e del lentivirus ecotropico, misurato su Slc-hRMS.

Figura 3. Ottimizzazione delle concentrazioni di condroitina solfato/polibrene (CS/PB) in fibroblasti dermici umani. (A) Vitalità dei fibroblasti dermici umani misurata mediante saggio MTT dopo la trasduzione in presenza di PB soltanto o con diverse concentrazioni di CS/PB. (B) Miglioramento dell'efficienza di trasduzione nei fibroblasti dermici umani ottenuto con diverse concentrazioni di CS/PB, misurato mediante FACS. (C) Quantificazione del miglioramento della trasduzione, che mostra come la trasduzione massima si verifichi a 100 μg/ml di CS/PB.

Figura 4. Effetto di 400 μg/ml di CS/PB sulla trasduzione di Slc-hRMS con lentivirus ecotropico. (A) Aumento del titolo e (B) variazione del tasso di trasduzione rispetto a 6 μg/ml di polibrena da sola.

Figura 5. Assenza di trasduzione ecotropica dei fibroblasti dermici umani (HDF) in assenza del recettore del retrovirus murino Slc7a1. (A) Diagramma FACS di fibroblasti umani BJ, non trasdotti (rosa) o trasdotti (blu) con lentivirus GFP ecotropico, in entrambi i casi in assenza del recettore Slc7a1. Fibroblasti umani BJ trasdotti con lentivirus GFP ecotropico, senza (B) e con (C) pre-trasduzione con il recettore Slc7a1 (4X).

Discussione

Ricombinante gammaretrovirus ecotropic basato sul virus della leucemia murina Moloney (MLV) e il suo recettore mSlc7a1 sono ben studiati e ampiamente disponibili, siano stati utilizzati per oltre 20 anni per fornire transgeni alle cellule murine. Gammaretrovirus Ecotropic è stato usato più di recente per fornire oncogeni alle cellule umane;. Nell'ambito della riprogrammazione cellulare, l'uso di mSlc7a1 per evitare la generazione di virus oncogeni amphotropic ospitare umano è ben consolidata ^4,5 Tuttavia, lentivirus offre vantaggi significativi rispetto gammaretrovirus nella trasduzione popolazioni di cellule refrattario, compresi ⁶ celle primarie, che sono spesso obiettivi auspicabili per la riprogrammazione, in quanto il lentivirale pre-integrazione di trasduzione del complesso permette di non dividere le celle ^7.

Lentivirus sono state prodotte con decine di pseudotypes diversi, tra cui MLV, nel tentativo di alterare tropismo del virus, la tossicità, e altre proprietà. ⁸ MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic è stato utilizzato per trasdurre cellule di topo, ⁹ ma raramente è stato utilizzato su cellule umane ^10. Proponiamo quindi l'uso di MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic come un veicolo sicuro, conveniente e altamente efficiente per fornire oncogeni noti o sospetti, tra cui i fattori di riprogrammazione cellulare, alle cellule umane.

È fondamentale notare che questo protocollo non del tutto elimina la necessità di produrre e utilizzare lentivirus pantropic, anzi, questo protocollo separa l'oncogene (s) dal virus pantropic, isolante ricercatori potenziale di auto-inoculazione con cancro-correlata virus. Il mSlc7a1 proteina e il suo omologo umano hSlc7a1 sono espresse ubiquitariamente trasportatori di aminoacidi senza tumorigenicità note o la capacità di conferire un vantaggio selettivo di crescita su cellule riceventi, ¹¹ mSlc7a1 realizzazione di rischio relativamente basso per incorporazione in amphotropic virus. Questo passo ha aggiunto può essere particolarmente utile nei laboratori privi di virus o strutture dedicate coltura dei tessuti del livello richiesto biosicurezza.

In alcune situazioni può essere possibile eliminare completamente l'uso di virus pantropic dalla trasfezione del plasmide Slc7a1 direttamente nelle cellule bersaglio, tuttavia, molte cellule che sarebbe utile obiettivi di questa tecnica sono refrattari alla trasfezione. In alternativa, la capacità di isolare Slc7a1-trasdotte dalla selezione blasticidin significa che VSV-G lentivirus pseudotyped può essere utilizzato una sola volta per generare uno stock di cellule che esprimono recettori, dopo di che virus ecotropic può essere utilizzato di routine per trasdurre queste cellule per molti esperimenti. I ricercatori dovrebbero sempre seguire le loro linee guida di sicurezza istituzionali per lavorare con qualsiasi lentivirus, indipendentemente dal suo tropismo.

I titoli del virus ecotropic ottenuti con questo protocollo sono moderatamente inferiori VSV-pseudotyped virus, in genere il 10-20% del titolo virus pantropic, in accordo con precedenti studi. ⁹ Questi titoli sono stati misurati in cellule umane trasdotte stabilmente con Slc7a1, in modo che il minore titolo osservato per ecotropic virus può essere in parte a causa di variegata espressione del gene del recettore nelle cellule bersaglio. Tuttavia, la titoli virale raggiunto nel nostro protocollo sono più che sufficienti per la maggior parte delle applicazioni e portare alla trasduzione della maggior parte delle cellule, in alcuni casi> 90% delle cellule.

Centrifugazione basati su tecniche sono comunemente utilizzati per concentrare le particelle virali. Tuttavia, centrifugazione richiede diverse ore, genera aerosol infettivi, e può causare una perdita significativa di particelle virali. ¹² In alternativa, la complessazione con CS / PB può essere usato per migliorare la trasduzione senza alterare tropismo virale. ³ Questo metodo è rapido (5 minuti ) e poco costoso (0,03 dollari per 10 ml di virus), mentre circa triplicando il titolo osservato. Non occorrono attrezzature o reagenti proprietari sono tenuti, e abbiamo osservato minima tossicità acuta dopo l'esposizione di HDFS di CS / PB, in accordo con precedenti lavori in altre linee cellulari. ¹³ Un potenziale svantaggio di questo protocollo è che alcuni complessi microscopicamente visibili polimero aderire le cellule per diversi giorni in coltura. Non possiamo escludere la possibilità che questi complessi, anche se non apertamente tossico per le cellule, possono avere effetti più sottili sui processi cellulari.

Qui abbiamo descritto una metodologia per la sicura ed efficiente trasduzione cellule umane con fattori oncogenici. Questo approccio dovrebbe essere di grande utilità per i ricercatori che studiano oncogeni e biologia delle cellule staminali comprese le cellule iPS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	MLV recettore murino
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G busta
pCMV-dR8.91	D. Trono di laboratorio 14		Packaging plasmide (equivalente psPax2 plasmide è disponibile presso Addgene, cat. Numero 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Busta Ecotropic
FUGW	Addgene	14883	GFP plasmide di controllo
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromuro (polibrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Condroitin solfato di sodio sale da cartilagine di squalo	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Pescatore	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021