Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Sommario

Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l'utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.

Abstract

Staminali tumorali e studi di biologia cellulare spesso richiedono trasduzione virale delle cellule umane con oncogeni noti o sospetti, sollevando problemi di sicurezza maggiori per il personale di laboratorio. Lentivirus Pantropic, come comunemente utilizzati VSV-G pseudotype, sono uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene perché possono trasdurre molti tipi di cellule, comprese le cellule non si dividono. Tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione e la centrifugazione di virus oncogeni pantropic codifica per esigenze di più alto livello la gestione di biosicurezza e le questioni di sicurezza. Diversi oncogeni potenti, tra cui c-Myc e SV40 T antigene di grandi dimensioni, sono noti per aumentare la produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC). Tutti gli altri noti cambiamenti genetici che inducono IPSC (Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, LIN28, e la perdita della funzione di p53) hanno anche i link al cancro, che li rende di preoccupazione per la sicurezza relativamente elevata.

Anche se questi tumori correlati virus sono utili per studiare la riprogrammazione cellulare e pluripotenza, devono essere usati in modo sicuro. Per affrontare questi problemi di biosicurezza, abbiamo dimostrato un metodo per la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropic, con enfasi sulla riduzione dei costi e gestione conveniente. Abbiamo prodotto lentivirus ecotropic con titolo sufficientemente elevato per trasdurre superiore al 90% del esprimono i recettori delle cellule umane esposte al virus, convalidando l'efficacia di questo approccio.

Lentivirus è spesso concentrata per ultracentrifugazione, tuttavia, questo processo richiede diverse ore e può produrre aerosol infettivi a uomo ricercatori biomedici. In alternativa, le particelle virali possono essere più sicuro sedimentano sulla cellule per complessazione con solfato di condroitina e polibrene (CS / PB). Questa tecnica aumenta il titolo funzionale virale fino a 3 volte nelle cellule che esprimono stabilmente recettore retrovirus murino, con trascurabili tempo aggiunto e costo. Trasduzione di fibroblasti cutanei umani (HDFS) è al massimo migliorata utilizzando CS / PB concentrazioni di circa 4 volte inferiore al valore ottimale riportato in precedenza per le linee di cellule tumorali, suggerendo che la concentrazione polimero deve essere titolato per il tipo di destinazione delle cellule di interesse. Abbiamo quindi descritto l'uso di methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) al dosaggio per la tossicità dei polimeri in un nuovo tipo di cellula. Osserviamo vitalità equivalente di HDFS dopo trasduzione virale utilizzando complessazione polimero o la dose standard di polibrene (PB, 6 mg / ml), con l'indicazione minima tossicità acuta.

In questo protocollo, si descrive l'utilizzo di lentivirus ecotropic per la sovraespressione di oncogeni nelle cellule umane, riducendo i rischi di biosicurezza e l'aumento del tasso di trasduzione. Abbiamo anche dimostrare l'uso di complessazione polimero per migliorare la trasduzione, evitando di aerosol centrifugazione formazione di particelle virali.

Protocollo

1. Produzione, raccolta e congelamento di lentivirus

1. Consulta il tuo funzionario per la sicurezza istituzionale prima di iniziare questo protocollo e segui le linee guida di sicurezza consigliate.
2. Giorno 1. Inizia con cellule 293T sane e in rapida crescita per produrre virus. Piastra le celle a 5 x 10⁶ celle per piastra da 10 cm. Utilizzare un terreno 293T privo di antibiotici (DMEM ad alto contenuto di glucosio con il 10% di FBS e 4 mM di L-glutammina) per la produzione di virus.
3. Giorno 2. Nel tardo pomeriggio, trasfettare le cellule 293T come segue (i numeri indicati si riferiscono a una piastra da 10 cm). Lasciare che tutti i reagenti si riscaldino a temperatura ambiente. Pipettare 375 μl di OptiMEM in una provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 μl Fugene HD. Evitare che Fugene non diluito entri in contatto con la superficie del tubo.
4. In una provetta da microcentrifuga, mescolare:
   • Plasmide di trasferimento da 5 μg (Slc7a1, vettore bersaglio o vettore di controllo fluorescente)
   • Plasmide di imballaggio da 3,75 μg (pCMV-dR8.91 o psPax2)
   • Plasmide a busta da 1,25 μg (pMD2.G per pantropico, pHCMV-EcoEnv per ecotropico)
   • OptiMEM senza siero fino a 100 μl
5. Unire le due provette e incubare la miscela per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
6. Cambiare il terreno sulle cellule 293T in 10 ml di terreno 293T fresco privo di antibiotici. Aggiungere il mix Fugene/plasmide goccia a goccia fino alla piastra e incubare per una notte a 37°C, 5% CO₂.
7. Giorno 3. Cambiare il terreno sulle cellule 293T in 10 ml di terreno 293T fresco privo di antibiotici. Sii gentile, perché le cellule 293T aderiscono solo liberamente e possono staccarsi dal terreno pipettato con troppa forza sul monostrato. Incubare per due giorni in un incubatore umidificato per la produzione di virus.
8. Giorno 5. Raccogli il virus e filtra con un filtro a basso legame proteico da 0,45 mm. Utilizzare immediatamente o erogare in aliquote monouso e congelare a -80°C. Il virus pantropico ed ecotropo congelato deve essere rititolato dopo che è stato conservata rispettivamente per sei mesi e un mese.
9. Titola il virus come segue, utilizzando cellule relativamente suscettibili di trasduzione. Trasdurre le cellule con il virus di controllo fluorescente durante la notte utilizzando diluizioni seriali (ad es. 1:10, 1:100, 1:1000) in terreno fresco con 6 μg/ml di PB. Passare a un terreno fresco il giorno successivo. Lasciare che le cellule due giorni dopo la trasduzione inizino a esprimere la proteina fluorescente, quindi determinare la frazione di cellule trasdotte mediante FACS. Calcolare il titolo in unità trasformanti (TU) per ml, sulla base di diluizioni che producono < trasduzione del 15% per ridurre al minimo gli eventi di trasduzione multipli.
   

2. Trasduzione di cellule bersaglio umane con il recettore del retrovirus murino Slc7a1

1. Selezionare una molteplicità di infezioni (MOI) = 2 per garantire che la maggior parte delle cellule venga trasdotta. Per le cellule bersaglio resistenti alla trasduzione come gli HDF, sarà richiesto un MOI più elevato; Diluiamo il surnatante virale solo 1:2 per ottenere la trasduzione della maggior parte delle cellule.
2. Trasdurre le cellule bersaglio durante la notte con surnatante virale diluito in terreno di coltura fresco con 6 μg/ml di PB, che aumenta la trasduzione migliorando l'interazione elettrostatica tra il virus e la cellula bersaglio. ¹ Idealmente si dovrebbe usare un volume minimo di virus, come 1 ml per una piastra da 35 mm, perché la diffusione è un fattore limitante nell'efficienza di trasduzione.
3. Colture di cellule per almeno 48 ore dopo la rimozione del virus prima di trasdurle con il virus ecotropico, al fine di garantire un'espressione sufficiente del recettore Slc7a1.
4. (Facoltativo) Se lo si desidera, è possibile utilizzare la blasticidina per selezionare cellule che esprimono Slc7a1 in modo stabile e trasdotte. Una curva di uccisione della blasticidina dovrebbe essere generata in anticipo per determinare la concentrazione efficace più bassa, generalmente compresa tra 2 e 10 μg/ml, che uccide tutte le cellule bersaglio non trasdotte in 7 giorni. Circa 2 giorni dopo la rimozione del virus Slc7a1, passare le cellule trasdotte in un terreno contenente blasticidina. Coltivare le cellule in un terreno contenente blasticidina per 7 giorni, a quel punto tutte le cellule rimanenti esprimeranno stabilmente il recettore del retrovirus, a quel punto potranno essere trasdotte con il virus ecotropo e conservate per un uso futuro come una linea stabile che esprime Slc7a1.

3. Titolazione del complesso polimerico per determinare la tossicità

1. Giorno 1. Piastre di celle a 5000 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, consentendo almeno pozzetti triplicati per ogni gruppo sperimentale. Includere cellule non trasdotte in terreno completo per fornire un valore di base per le cellule sane, nonché campioni costituiti da cellule in terreno privo di siero per indurre l'arresto della crescita come controllo. In parallelo, piastre in un formato appropriato (come una piastra a 24 pozzetti) per l'analisi microscopica o basata su FACS dell'efficienza di trasduzione in ciascuna condizione sperimentale.
2. Giorno 2. Trasdurre le cellule in piastre impostate per le analisi MTT e FACS con virus che codifica per GFP, a un MOI di 0,5 per trasdurre ~40% delle cellule bersaglio. Testare varie concentrazioni di CS/PB (ad es. 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg/ml di ciascun componente), nonché 6 μg/ml di PB, per determinare le quantità ottimali. Generare complessi polimerici come descritto nella Parte 4, di seguito.
3. Giorno 3. Rimuovere il terreno contenente virus e sostituirlo con un terreno nuovo. Rimetti le piastre in un'incubatrice umidificata.
4. Giorno 5. Analizza la piastra FACS per determinare l'efficienza di trasduzione con ciascuna concentrazione di polimero.
5. Giorno 6. Rimuovere il terreno da tutti i pozzetti della piastra MTT e sostituirlo con 100 μl di soluzione MTT (1 mg/ml di MTT in terreno completo). Coltura per tre ore in un incubatore umidificato per consentire la riduzione dell'MTT nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive.
6. Rimuovere la soluzione di MTT e sostituirla con 200 ml di solvente MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanolo).
7. Incubare per due ore a temperatura ambiente o fino a quando tutto il precipitato viola di formazan MTT è disciolto. Leggere l'assorbanza su un lettore di micropiastre a 570 nm, sottraendo la lettura di fondo a 690 nm.
8. Selezionare la concentrazione ottimale del polimero che produce il massimo miglioramento della trasduzione, come determinato dal FACS, con un effetto minimo sull'attività metabolica, come determinato dall'MTT. Per gli HDF, abbiamo selezionato 100 μg/ml di CS/PB sulla base dei dati mostrati nei risultati rappresentativi di seguito.

4. Trasduzione ecotropica con complessazione polimerica

1. Preparare soluzioni madre filtrate sterili di PB e condroitina solfato a 20 mg/ml in acqua. Aliquotare e conservare a -20°C.
2. Pipettare il surnatante virale in una provetta da microcentrifuga e diluire fino alla concentrazione finale desiderata (ad es. MOI di 2) con terreno di coltura fresco. Aggiungere volumi uguali di PB e condroitina solfato (concentrazioni determinate al punto 3 sopra) in successione, muovendo il tubo per mescolare dopo ogni aggiunta. La miscela virale diventerà immediatamente torbida man mano che si formano i precipitati. Incubare la miscela virale a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la formazione di un complesso.
3. Rimuovere i terreni dalle cellule bersaglio che esprimono il recettore, sostituirli con la miscela virale e incubare per una notte a 37°C, 5% di CO2. Dopo aver rimosso la miscela virale, lavare la superficie delle cellule due volte con PBS per facilitare la rimozione dei complessi virali. Non è necessaria la rimozione completa; Non abbiamo osservato effetti negativi sulla salute delle cellule da complessi polimerici residui.

5. Verifica della specificità della trasduzione ecotropica

1. Quando si produce un virus ecotropo per la prima volta, è prudente dal punto di vista della sicurezza verificare che il virus non sia in grado di trasdurre cellule umane non modificate. Trasdurre cellule umane con lentivirus ecotropico a una concentrazione relativamente alta (solo una diluizione da 1 a 2 volte del surnatante virale in terreno fresco) durante la notte con 6 μg/ml di PB o concentrazione CS/PB ottimizzata.
2. Rimuovere il terreno contenente virus e sostituirlo con un terreno nuovo. Dopo aver incubato le cellule per 2 giorni, convalidare l'espressione del transgene mediante FACS utilizzando vettori fluorescenti e/o mediante RT-PCR con primer specifici per il transgene.

6. Risultati rappresentativi:

La Fig. 1A mostra il processo di produzione del lentivirus e la Fig. 1B mostra la trasduzione delle cellule umane con il lentivirus ecotropico, inclusa la pre-trasduzione con il recettore del retrovirus murino Slc7a1. Per la titolazione del virus, utilizziamo una linea cellulare umana di rabdomiosarcoma trasdotta stabilmente con Slc7a1 (Slc-hRMS). Quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza di trasduzione, si ottiene regolarmente >'efficienza di trasduzione del 90% di Slc-hRMS con virus ecotropico, come mostrato nelle Fig. 2A e 2B. I tassi di trasduzione degli HDF sono generalmente più bassi perché le cellule non sono state selezionate con la blasticidina per l'espressione del recettore (Fig. 2C). I titoli di lentivirus ecotropico sono generalmente il 10-20% del virus pseudotipizzato VSV quando misurati su Slc-hRMS (Fig. 2D).

Un ciclo di congelamento-disgelo riduce il titolo del virus ecotropico del 16 - 3%, pari alla perdita del titolo durante un singolo ciclo di congelamento-disgelo del virus pseudotipizzato VSV (p > 0,05). Contrariamente a quanto riportato in ^precedenza,2 non osserviamo alcun effetto positivo sul titolo del virus dal congelamento improvviso nel ghiaccio secco. Piuttosto, otteniamo titoli post-scongelamento più elevati di entrambi gli pseudotipi semplicemente posizionando provette di virus in un congelatore a -80°C (dati non mostrati).

Il test di vitalità MTT consente di rilevare in modo sensibile l'arresto della crescita nelle cellule bersaglio. La trasduzione con virus e concentrazioni di CS/PB fino a 800 μg/ml non ha alcun effetto sul metabolismo dell'HDF (Fig. 3A). Anche l'esposizione a CS/PB senza virus non ha effetti tossici sulle cellule (dati non mostrati). L'analisi FACS degli HDF trasdotti con il virus e di varie concentrazioni di CS/PB mostra un aumento della trasduzione rispetto al solo PB (Fig. 3B). L'aumento massimo si verifica a 100 μg/ml di CS/PB (Fig. 3C), diverse volte inferiore ai valori precedentemente riportati. ³ Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per un dato tipo di cellula bersaglio.

La complessazione con CS/PB aumenta il titolo osservato di circa 3 volte in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0,01). In pratica, ciò produce un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate (Fig. 4B), che è molto probabilmente dovuto alla moltiplicazione delle cellule trasdotte e alla saturazione del recettore a concentrazioni virali più elevate.

La trasduzione con il virus ecotropico è specifica per le cellule che esprimono il recettore del retrovirus murino. Quando si trasducono cellule umane non modificate con virus ecotropico, non abbiamo osservato una fluorescenza maggiore del fondo non trasdotto, sia con PB che con CS/PB, come mostrato in Fig. 5A. Microscopicamente, gli HDF non mostrano alcuna trasduzione in assenza di recettore (Fig. 5B) mentre la pre-trasduzione con recettore provoca cellule fluorescenti (Fig. 5C).

Figura 1. Vista schematica di (A) il processo di produzione del virus e (B) la trasduzione di cellule umane con il recettore del retrovirus murino seguito dal lentivirus ecotropico.

Figura 2. Trasduzione ad alta efficienza di cellule umane con lentivirus ecotropico che codifica per GFP. Le cellule sono state pre-trasdotte con il recettore del retrovirus murino Slc7a1. (A) Linea cellulare di rabdomiosarcoma umano blasticidina selezionata per Slc7a1 (Slc-hRMS), trasdotta (blu) o non trasdotta (rosa) con GFP. (B) Micrografia fluorescente di Slc-hRMS trasdotto ecotropico (4X). (C) HDFs trasdotti (blu) e non trasdotti (rosa) con lentivirus ecotropico GFP; le cellule sono state trasdotte con Slc7a1 due giorni prima della trasduzione ecotropica. (D) Titolo di lentivirus pseudotipizzato ed ecotropo VSV-G, misurato su Slc-hRMS.

Figura 3. Ottimizzazione delle concentrazioni di condroitina solfato/polibrene (CS/PB) nei fibroblasti dermici umani. (A) Vitalità degli HDF misurata mediante saggio MTT dopo trasduzione in presenza di solo PB o con concentrazioni variabili di CS/PB. (B) Aumento dell'efficienza di trasduzione negli HDF mediante diverse concentrazioni di CS/PB, misurate mediante FACS. (C) Quantificazione dell'aumento della trasduzione, dimostrando che la trasduzione massima avviene a 100 μg/ml CS/PB.

Figura 4. Effetto di 400 μg/ml di CS/PB sulla trasduzione di Slc-hRMS con lentivirus ecotropico. (A) Aumento del titolo e (B) variazione della velocità di trasduzione rispetto al solo polibrene da 6 μg/ml.

Figura 5. Mancanza di trasduzione ecotropica degli HDF in assenza del recettore del retrovirus murino Slc7a1. (A) Grafico FACS di fibroblasti umani BJ, non trasdotti (rosa) o trasdotti (blu) con lentivirus ecotropico GFP in entrambi i casi in assenza del recettore Slc7a1. Fibroblasti umani BJ trasdotti con lentivirus ecotropico GFP, senza (B) e con (C) pre-trasduzione con il recettore Slc7a1 (4X).

Discussione

Ricombinante gammaretrovirus ecotropic basato sul virus della leucemia murina Moloney (MLV) e il suo recettore mSlc7a1 sono ben studiati e ampiamente disponibili, siano stati utilizzati per oltre 20 anni per fornire transgeni alle cellule murine. Gammaretrovirus Ecotropic è stato usato più di recente per fornire oncogeni alle cellule umane;. Nell'ambito della riprogrammazione cellulare, l'uso di mSlc7a1 per evitare la generazione di virus oncogeni amphotropic ospitare umano è ben consolidata ^4,5 Tuttavia, lentivirus offre vantaggi significativi rispetto gammaretrovirus nella trasduzione popolazioni di cellule refrattario, compresi ⁶ celle primarie, che sono spesso obiettivi auspicabili per la riprogrammazione, in quanto il lentivirale pre-integrazione di trasduzione del complesso permette di non dividere le celle ^7.

Lentivirus sono state prodotte con decine di pseudotypes diversi, tra cui MLV, nel tentativo di alterare tropismo del virus, la tossicità, e altre proprietà. ⁸ MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic è stato utilizzato per trasdurre cellule di topo, ⁹ ma raramente è stato utilizzato su cellule umane ^10. Proponiamo quindi l'uso di MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic come un veicolo sicuro, conveniente e altamente efficiente per fornire oncogeni noti o sospetti, tra cui i fattori di riprogrammazione cellulare, alle cellule umane.

È fondamentale notare che questo protocollo non del tutto elimina la necessità di produrre e utilizzare lentivirus pantropic, anzi, questo protocollo separa l'oncogene (s) dal virus pantropic, isolante ricercatori potenziale di auto-inoculazione con cancro-correlata virus. Il mSlc7a1 proteina e il suo omologo umano hSlc7a1 sono espresse ubiquitariamente trasportatori di aminoacidi senza tumorigenicità note o la capacità di conferire un vantaggio selettivo di crescita su cellule riceventi, ¹¹ mSlc7a1 realizzazione di rischio relativamente basso per incorporazione in amphotropic virus. Questo passo ha aggiunto può essere particolarmente utile nei laboratori privi di virus o strutture dedicate coltura dei tessuti del livello richiesto biosicurezza.

In alcune situazioni può essere possibile eliminare completamente l'uso di virus pantropic dalla trasfezione del plasmide Slc7a1 direttamente nelle cellule bersaglio, tuttavia, molte cellule che sarebbe utile obiettivi di questa tecnica sono refrattari alla trasfezione. In alternativa, la capacità di isolare Slc7a1-trasdotte dalla selezione blasticidin significa che VSV-G lentivirus pseudotyped può essere utilizzato una sola volta per generare uno stock di cellule che esprimono recettori, dopo di che virus ecotropic può essere utilizzato di routine per trasdurre queste cellule per molti esperimenti. I ricercatori dovrebbero sempre seguire le loro linee guida di sicurezza istituzionali per lavorare con qualsiasi lentivirus, indipendentemente dal suo tropismo.

I titoli del virus ecotropic ottenuti con questo protocollo sono moderatamente inferiori VSV-pseudotyped virus, in genere il 10-20% del titolo virus pantropic, in accordo con precedenti studi. ⁹ Questi titoli sono stati misurati in cellule umane trasdotte stabilmente con Slc7a1, in modo che il minore titolo osservato per ecotropic virus può essere in parte a causa di variegata espressione del gene del recettore nelle cellule bersaglio. Tuttavia, la titoli virale raggiunto nel nostro protocollo sono più che sufficienti per la maggior parte delle applicazioni e portare alla trasduzione della maggior parte delle cellule, in alcuni casi> 90% delle cellule.

Centrifugazione basati su tecniche sono comunemente utilizzati per concentrare le particelle virali. Tuttavia, centrifugazione richiede diverse ore, genera aerosol infettivi, e può causare una perdita significativa di particelle virali. ¹² In alternativa, la complessazione con CS / PB può essere usato per migliorare la trasduzione senza alterare tropismo virale. ³ Questo metodo è rapido (5 minuti ) e poco costoso (0,03 dollari per 10 ml di virus), mentre circa triplicando il titolo osservato. Non occorrono attrezzature o reagenti proprietari sono tenuti, e abbiamo osservato minima tossicità acuta dopo l'esposizione di HDFS di CS / PB, in accordo con precedenti lavori in altre linee cellulari. ¹³ Un potenziale svantaggio di questo protocollo è che alcuni complessi microscopicamente visibili polimero aderire le cellule per diversi giorni in coltura. Non possiamo escludere la possibilità che questi complessi, anche se non apertamente tossico per le cellule, possono avere effetti più sottili sui processi cellulari.

Qui abbiamo descritto una metodologia per la sicura ed efficiente trasduzione cellule umane con fattori oncogenici. Questo approccio dovrebbe essere di grande utilità per i ricercatori che studiano oncogeni e biologia delle cellule staminali comprese le cellule iPS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	MLV recettore murino
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G busta
pCMV-dR8.91	D. Trono di laboratorio 14		Packaging plasmide (equivalente psPax2 plasmide è disponibile presso Addgene, cat. Numero 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Busta Ecotropic
FUGW	Addgene	14883	GFP plasmide di controllo
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromuro (polibrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Condroitin solfato di sodio sale da cartilagine di squalo	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Pescatore	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021