Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Sommario

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Abstract

Nonostante i progressi nella modellazione tossicità dei farmaci umani, molti composti non durante gli studi clinici per effetti collaterali imprevisti. Il costo degli studi clinici sono notevoli, quindi è essenziale che più schermi tossicologia predittiva sono sviluppati e distribuiti nelle prime fasi di sviluppo dei farmaci (Greenhough et al 2010). Epatociti umani rappresentano il modello attuale gold standard per valutare la tossicità della droga, ma sono una risorsa limitata che presentano la funzione variabile. Pertanto, l'uso di linee cellulari immortalizzate e modelli tessuti animali sono normalmente impiegati per la loro abbondanza. Mentre entrambe le fonti sono informativi, essi sono limitati dalla scarsa funzionalità, la variabilità delle specie e / o instabilità nella cultura (Dalgetty et al 2009). Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono una fonte interessante alternativa di epatociti umani come cellule (HLCS) (Medine et al 2010). PSC sono in grado di rinnovamento del sé e la differenziazione di tutti i tipi di cellule somatiche trovato negli adulti e, quindi, rappresentanouna fonte potenzialmente inesauribile di cellule differenziate. Abbiamo sviluppato una procedura che è semplice, altamente efficiente, suscettibili di automazione e rese funzionali HLCS umano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Crediamo che la nostra tecnologia porterà alla produzione scalabile di HLCS per la scoperta, la modellazione della malattia, la costruzione di dispositivi di extra-corporea e, eventualmente, le terapie cellulari a base di trapianto.

Protocollo

1. Preparazione iniziale di tutti gli stock chimica e rivestimento della cultura Plasticware

Tutti i passaggi da effettuare in una cappa di coltura dei tessuti in condizioni asettiche.

1. Preparazione delle risorse umane fattore di crescita fibroblastico (hbFGF)
   1. Preparare soluzione al 10% BSA in PBS e filtrare su un filtro di 0,22 micron.
   2. Dalla soluzione al 10% di BSA preparare una soluzione 0,2% BSA.
   3. Aggiungere 10 ml 0,2% di BSA hbFGF mcg solution/100.
   4. Pre-bagnato di un filtro da 0,22 micron di filtraggio 5 ml di soluzione di BSA al 10% attraverso il filtro. Eliminare i 10 ml BSA lavaggio.

Discussione

Abbiamo sviluppato un modello semplice, omogeneo e altamente riproducibili in vitro per generare livelli scalabili di HLCS umano. Il nostro modello è stato convalidato da una serie di laboratori esterni collaborazione. Noi abitualmente caratterizzano HLCS cellule staminali derivate usando il nostro strumento di casa nella casella dei marcatori dello sviluppo e del fegato analisi specifiche funzionali (la maggior parte dei quali sono disponibili in commercio). Le fasi critiche del nostro processo sono: il manten.......

Materiali

Lastre di verniciatura Matrigel e fiaschi

1. Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); conservare a -20 ° C.
2. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C.
3. Piastre di coltura tissutale (6 bene, ben 12, Corning, UK)
4. Tessuto fiasco cultura (25 cm2 ventilati, Corning, UK)

hESC manutenzione

1. Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, USA); conservare a -20 ° C.
2. BSA soluzione (50 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C.
3. Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C.

HESC Passaging con collagenasi

1. Ben confluenti o fiasco di hESC.
2. Matrigel pozzi rivestiti o fiaschi a seconda dei casi.
3. Fosfato salina tamponata (-MgCl _{2,-CaCl 2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a temperatura ambiente.
4. Collagenasi IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); conservare a 4 ° C.
5. Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, USA).
6. Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA).

Differenziazione delle hESC a endoderma epatica

1. RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C.
2. Supplemento B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C.
3. Activin A (2 mg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C.
4. Ricombinante Wnt3a del mouse (2 mg, R & D Systems, USA); conservare a -20 ° C.
5. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C.
6. KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C.
7. Aminoacidi non essenziali (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C.
8. β-mercaptoetanolo (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); conservare a temperatura ambiente
10. Leibovitz L-15 terreno di coltura (500 ml, SIGMuno Aldrich, UK); conservare a 4 ° C.
11. Triptosio fosfato brodo (100 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C.
12. Siero fetale bovino, inattivato con il calore (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C.
13. Idrocortisone 21-emisuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C.
14. Insulina (pancreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C.
15. L-Glutammina (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C.
16. Acido ascorbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C.
17. Umano HGF (10 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C.
18. Ricombinante umana oncostatina M (OSM) (50 mcg, R & D Systems, USA); conservare a -20 ° C.
19. Siringa guidato unità filtro 0,22 micron (Millipore, UK)

Caratterizzazione di Endoderma epatica derivati ​​dalle hESC

Immunocolorazione

1. Tampone fosfato salino (-MgCl _{2,-CaCl 2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); STOre a temperatura ambiente.
2. PBST, PBS composto con 0,1% di Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldeide (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) è costituito in PBS, conservare a -20 ° C.
4. Glicerolo (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente.
5. Tris base (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente.
6. Etanolo
7. Siero (ABD Serotech, UK), conservare a -20 ° C.
8. Anticorpo secondario, Fluorofori Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) è realizzata in Tris HCL e glicerolo come da istruzioni del produttore. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) è aggiunto alla soluzione MOWIOL a una diluizione 1:1000.

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi primari
Antigen *	Tipo	Fornitore	Diluizione
ALB	Monoclonali del mouse	Sigma Aldrich	1 / 500
E-caderina	Monoclonali del mouse	Millipore	1 / 100
α-fetoproteina	Monoclonali del mouse	Sigma	1 / 500
SSE-4 FITC	Monoclonali del mouse	Biolegend	1 / 100
IgG	Monoclonali del mouse	DAKO	1 / 500
Anticorpi secondari
Anti-topo coniugato FITC	Capra monoclonali	Invitrogen	1 / 400

Tabella 2. Gli anticorpi utilizzati per immunocolorazione epatiche derivate endoderma hESC, le concentrazioni utilizzate, la specie ha sviluppato nel e le società che essi siano acquistati.

Analisi funzionale di Endoderma epatica e Normalisation (per mg di proteina)

saggi citocromo P450

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kit e luminometro (Promega, USA).
1. Bianco fondo piatto piastra da 96 dosaggio bene (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Trasparente piastra da 96 dosaggio bene (Iwaki, UK)