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1. Funzionalizzazione dell'array con l'anticorpo biotinilato
- Prepara le seguenti soluzioni.
- Tampone T50, una soluzione di 10 mM di Tris-HCl (pH 8,0) e 50 mM di NaCl. La soluzione è stabile per 1 mese presso RT.
- T50-BSA integrando il tampone T50 con 0,1 mg/mL di BSA. Conservare la soluzione preparata in ghiaccio.
- 10 mg/mL di boroidruro di sodio (NaBH4) in 1x PBS. Prepararlo immediatamente prima dell'uso.
- 0,2 mg/mL di NeutrAvidin (vedi Tabella dei materiali) in tampone T50.
cautela: NaBH4 è un agente riducente ed è infiammabile. Spurgare sempre il contenitore con azoto gassoso dopo l'uso e conservarlo in un essiccatore.
- Funzionalizzare l'array con l'anticorpo biotinilato.
- Rimuovere gli array funzionalizzati PEG-biotina dal congelatore ed equilibrare il tubo conico su RT prima di aprirlo. Posizionare il vetrino coprioggetti con l'array orientato verso l'alto su un piatto di coltura tissutale da 100 mm (TC100) rivestito di pellicola sigillante.
nota: Riduci al minimo l'illuminazione dall'alto. Tutte le soluzioni dovrebbero "gonfiarsi" sui quadrati definiti dall'array idrofobico. Aggiungere un volume appropriato di soluzione per coprire completamente ogni quadrato (in genere 10-15 μL) e non lasciare che il liquido superi lo spazio definito. Per rimuovere rapidamente i liquidi, utilizzare una linea di vuoto interna collegata a un pallone sottovuoto per catturare i rifiuti. Lasciare degassare NaBH4 per 1 ora prima dello smaltimento lasciando il tubo aperto nella cappa chimica. Il trattamento con NaBH4 è necessario per ridurre l'autofluorescenza di fondo, riducendo così i rilevamenti di singole molecole false-positive.
- Trattare ogni quadrato dell'array con 10 mg/mL di NaBH4 in 1x PBS per 4 minuti a RT. Lavare tre volte con PBS.
- Incubare ogni quadrato per 5 minuti con 0,2 mg/mL di NeutrAvidin in T50. Lavare tre volte con T50-BSA.
nota: NeutrAvidin si lega alla PEG-biotina e fornisce un sito di legame per gli anticorpi biotinilati.
- Incubare ogni quadrato per 10 minuti con 2 μg/mL di anticorpo biotinilato specifico per POI in T50-BSA; lavare tre volte con T50-BSA.
nota: Il presente protocollo utilizza IgG biotinilate anti-EGFR (vedi Tabella dei materiali) per catturare EGFR-GFP.
2. SiMPull di POI da lisati a cellula intera
NOTA: Posiziona il piatto TC100 di array SiMPull funzionalizzati sul ghiaccio per il resto della preparazione di SiMPull. Questa fase è il pull-down di un POI dal lisato proteico totale. Il lisato non deve essere riutilizzato dopo lo scongelamento.
- Prepara le seguenti soluzioni.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA)/0,1% di glutaraldeide (GA) in 1x PBS.
cautela: PFA e GA sono fissativi chimici tossici e potenziali cancerogeni. Indossa i DPI. Smaltire le sostanze chimiche come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
- Preparare 10 mM di Tris-HCl, pH 7,4.
- Scongelare e mescolare il lisato pipettandolo delicatamente su e giù. Mantenere il ghiaccio.
- Diluire 1 μl di lisato in 100 μl di T50-BSA/PPI.
ghiacciato
nota: Se necessario, determinare il fattore di diluizione appropriato del lisato proteico totale applicando una gamma di diluizioni all'array. La densità ottimale dei recettori SiMPull per area dell'array è 0,04-0,08/μm2.
- Incubare il lisato sull'array per 10 minuti, quindi lavare quattro volte con T50-BSA/PPI ghiacciato.
- Diluire l'anticorpo anti-fosfotirosina coniugato AF647 (vedere la tabella dei materiali) in T50-BSA/PPI ghiacciato e incubare sull'array per 1 h.
nota: Nel presente protocollo, una IgG pan anti-pTyr (PY99)-AF647 viene utilizzata per identificare la popolazione fosforilata di EGFR-GFP. L'uso di anticorpi marcati direttamente elimina la necessità di anticorpi secondari, aumentando le opzioni di marcatura e migliorando la coerenza dei risultati. Gli anticorpi marcati in fluorescenza possono essere ottenuti da fonti commerciali. Se non sono disponibili in commercio, gli anticorpi possono essere marcati su misura utilizzando tecniche di bioconiugazione standard e sono disponibili kit di bioconiugazione commerciali. Ogni lotto di anticorpi marcati in fluorescenza deve essere testato per verificare le condizioni ottimali di marcatura eseguendo SiMPull per misurare una curva di dose e trovare il punto di saturazione.
- Lavare sei volte con T50-BSA ghiacciato per un totale di 6-8 minuti.
- Lavare due volte con 1x PBS ghiacciato.
- Incubare l'array con una soluzione di PFA al 4% e GA allo 0,1% per 10 minuti per prevenire la dissociazione degli anticorpi.
- Lavare due volte per 5 minuti ciascuna con 10 mM di Tris-HCl, pH 7,4/PBS per inattivare i fissativi.
nota: Per gli esperimenti che utilizzano più di un anticorpo (ad esempio, rilevando più siti di fosfotirosina), ripetere i passaggi 2.5-2.9.
3. Acquisizione di immagini
NOTA: L'acquisizione di immagini a singola molecola viene eseguita utilizzando un obiettivo TIRF 150x e uno splitter di immagini che cattura ogni canale spettrale in un quadrante specifico della fotocamera emCCD (vedi Tabella dei materiali). Le immagini di calibrazione vengono prima acquisite per consentire la registrazione dei canali e la calibrazione del guadagno della fotocamera con una griglia di allineamento dei canali nanopatterned (nanogrid) che contiene 20 x 20 array di fori da 200 ± 50 nm a una distanza intraforo di 3 ± 1 μm (dimensione totale ~60 μm × 60 μm).
- Eseguire la registrazione del canale seguendo i passaggi seguenti.
nota: Per calcolare correttamente la colocalizzazione degli emettitori è necessaria una registrazione accurata dei canali. Questo passaggio è fondamentale.
- Pulisci l'obiettivo dell'olio e deposita una goccia d'olio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul tavolino per l'imaging. Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrati sul motivo della griglia.
nota: Le immagini con la nanogriglia vengono acquisite utilizzando la luce trasmessa, che passa attraverso la nanogriglia e viene rilevata in tutti i canali spettrali. In alternativa, è possibile utilizzare perle multifluorescenti che emettono la fluorescenza rilevata in ciascun canale. L'acquisizione delle immagini dovrà essere ottimizzata in base alla configurazione di ciascun microscopio.
- Acquisisci una serie di 20 immagini della griglia. Assicurati che i pixel non siano saturi. Salva la serie di immagini come "Fiducial".
- Sfocare la nanogriglia per creare un motivo Airy. Acquisisci una serie di 20 immagini per la calibrazione del guadagno. Salva l'immagine come "Guadagno".
- Acquisisci una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera bloccando tutta la luce che va alla fotocamera. Salva l'immagine come "Sfondo".
- Acquisisci immagini SiMPull.
nota: Prima di eseguire l'imaging dell'array di vetrini, sostituire la soluzione Tris con T50-BSA ed equilibrare l'array a RT.
- Pulire l'obiettivo dell'olio e depositare altro olio sull'obiettivo. Fissare il vetrino coprioggetti sul tavolino del microscopio.
- Ottimizza la potenza di eccitazione, l'angolo TIRF e il tempo di integrazione della fotocamera di ciascun fluoroforo. L'obiettivo è quello di ottenere il massimo rapporto segnale/rumore riducendo al minimo il fotobleaching del campione. Registra la potenza del laser per garantire la coerenza nelle misurazioni future.
nota: Il presente studio ha utilizzato un tempo di esposizione di 300 ms per il canale rosso lontano e 1 s per il canale verde. Il laser a 642 nm è stato utilizzato con una potenza laser di circa 500 μW, mentre il laser a 488 nm è stato utilizzato a 860 μW, misurato prima della lente del tubo.
- Acquisire immagini per ogni campione. Visualizzare prima il canale rosso lontano, seguito da ogni fluoroforo a lunghezza d'onda inferiore per ridurre il fotobleaching. A causa del basso volume utilizzato per ogni campione, controllare il livello del tampone ogni 30-45 minuti e rabboccare secondo necessità.