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1. Doppi strati lipidici planari
- Pulizia al plasma dei vetrini
nota: La pulizia al plasma rimuove i contaminanti organici e aumenta l'idrofilia del vetro, garantendo un efficiente adsorbimento dei lipidi. I seguenti passaggi possono cambiare o devono essere ottimizzati a seconda del pulitore al plasma e dei vetrini coprioggetti utilizzati.
- Spurgare il pulitore al plasma per 5 minuti con ossigeno per rimuovere l'aria dalle linee e dalla camera. Questo per garantire che, quando il pulitore al plasma viene eseguito, ci sia principalmente ossigeno nelle linee e nella camera, fornendo preparazioni a doppio strato più coerenti.
- Durante lo spurgo, versare un gas inerte, come N2 o Ar, sui vetrini di copertura micro per rimuovere polvere e particolato.
opzionale: I vetrini di copertura possono essere lavati spruzzando su ciascun lato con isopropanolo al 100% seguito da acqua. Ripetere il lavaggio con acqua di isopropanolo 3 volte e poi asciugare con un getto di N2.
- Disporre i vetrini di copertura asciutti in una culla in ceramica. Posizionare la culla sul retro della camera al plasma in modo che i vetrini coprioggetti siano paralleli al bordo lungo della camera (questo li mantiene in posizione durante la pulizia al plasma). Far funzionare il pulitore al plasma per 15 minuti con l'ossigeno alla massima potenza.
- Preparazione della camera
nota: Il metodo qui descritto utilizza camere fatte in casa da provette PCR di plastica per supportare i volumi di reazione, ma possono essere adatti anche altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone.
- Usando una lama di rasoio o delle forbici, tagliare il tappo appena sotto la parte smerigliata di una provetta PCR da 0,2 ml (Figura 1).
- Dipingi il bordo della provetta PCR con adesivo attivato dai raggi UV, evitando l'interno della provetta. Posizionare delicatamente la colla della provetta per PCR al centro di un vetrino coprioggetti pulito al plasma.
nota: Per evitare la colla all'interno della camera, utilizzare la quantità minima di colla per ottenere una tenuta e trattare prontamente con i raggi UV senza urtare o disturbare la camera.
- Posizionare la camera sotto la luce UV a lunghezza d'onda lunga per 5-7 minuti per polimerizzare l'adesivo.
- Formazione a doppio strato
nota: In questa fase è necessario utilizzare i SUV monodispersi per un'efficiente formazione del doppio strato. La tabella 1 fornisce le ricette per tutti i tamponi utilizzati nella formazione del doppio strato, comprese le concentrazioni di tampone stock e finali.
- Aggiungere 40 μl di tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabella 1), 10 μL di SUV da 5 mM e 1 μL di CaCl2 da 100 mM al pozzetto. Agitare delicatamente le camere da un lato all'altro per disturbare i SUV, quindi incubare a 37 °C per 20 min.
nota: Per limitare l'evaporazione, incubare in una capsula di Petri coperta con una salvietta umida.
- Lavare via i lipidi in eccesso
nota: Questo passaggio rimuove i SUV in eccesso e funge da passaggio di scambio del buffer. È molto importante non raschiare il doppio strato con la punta della pipetta durante il lavaggio; Se il vetro è esposto, le septine e molte altre proteine si legheranno in modo irreversibile, riducendo la concentrazione proteica effettiva.
- Dopo l'incubazione, sciacquare il doppio strato 6 volte con 150 μL di SLBB, pipettando su e giù per miscelare ogni volta evitando la formazione di bolle.
NOTA: Aggiungere 150 μL direttamente ai 50 μL di tampone e SUV già presenti per un totale di 200 μL nel pozzetto di reazione.
- Quando si è pronti per iniziare l'incubazione con le septine o con una proteina diversa a scelta, lavare il doppio strato 6 volte con 150 μL di tampone di reazione (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14% metilcellulosa, 1 mM BME).
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, preparare il tampone di reazione fresco e fare molta attenzione mentre si mescola bene la reazione per evitare bolle.
- Nell'ultima fase di lavaggio, rimuovere 125 μl di tampone di reazione, lasciando 75 μl nel pozzetto. Aggiungere 25 μL di septine diluite in tampone di conservazione per septina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) alla concentrazione desiderata e acquisire l'immagine mediante microscopia TIRF.
nota: Quando si imposta questo test per la prima volta o si incorpora una nuova composizione lipidica, è buona norma assicurarsi che i lipidi si diffondano liberamente sulla superficie utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP). Sebbene il tasso di recupero sia diverso per le diverse composizioni lipidiche e intrinsecamente inferiore a quello dei sistemi indipendenti, i lipidi non dovrebbero essere immobili.
Tabella 1: Componenti tampone per la preparazione del doppio strato lipidico supportato e delle reazioni. Vengono mostrati i volumi delle soluzioni madre incorporate nei tamponi e le concentrazioni finali di ciascun componente. SLB e PRB possono essere conservati a temperatura ambiente e riutilizzati tra un esperimento e l'altro. Il tampone di reazione e l'SSB vengono preparati freschi per ogni esperimento.
| Tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB) |
| ceppo | volume | Concentrazione finale |
| 2 M KCl | 1,5 ml | 300 mM |
| 1 M HEPES | 200 μl | 20 mM |
| 500 mM di MgCl2 | 20 μl | 1 mM |
| Acqua | 8 ml | |
| Tampone di pre-reazione (PRB) |
| ceppo | volume | Concentrazione finale |
| 2 M KCl | 166 μl | 33,3 mM |
| 1 M HEPES | 500 μl | 50 mM |
| Acqua | 9,33 ml | |
| Buffer di Reazione |
| ceppo | volume | Concentrazione finale |
| 2 M KCl | 166 μl | 33,3 mM |
| 1 M HEPES | 300 μl | 50 mM |
| 10 mg/mL di BSA | 1,39 ml | 1,39 mg/mL |
| 1% Metilcellulosa | 1,39 ml | 0,0014 |
| Acqua | Fino a 10 ml | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
| Buffer di archiviazione della septina (SSB) |
| ceppo | volume | Concentrazione finale |
| 2 M KCl | 1,5 ml | 300 mM |
| 1 M HEPES | 500 μl | 50 mM |
| Acqua | Fino a 10 ml | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
