Saggio del doppio strato lipidico supportato sferico: una tecnica per osservare l'assemblaggio della septina su microsfere

Abstract

Fonte: Curtis, B. N. et al., Ricostituzione dell'assemblaggio della septina alle membrane per studiare le proprietà e le funzioni biofisiche. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video descrive la tecnica di studio dell'assemblaggio della proteina septina su microsfere rivestite con doppi strati lipidici. Questa tecnica aiuta a comprendere gli assemblaggi di proteine dipendenti dalla curvatura su superfici curve.

Protocollo

1. Doppi strati lipidici supportati sferici

NOTA: Questo protocollo utilizza microsfere di silice sospese in acqua ultrapura al 10% di densità. Per qualsiasi lavoro sui parametri cinetici dell'assemblaggio delle proteine, è importante controllare rigorosamente l'area superficiale totale della membrana tra gli esperimenti e le curvature. La tabella 1 mostra i volumi corretti delle perle e del tampone per mantenere 5^mm2 di superficie totale della membrana.

1. Formazione a doppio strato
   nota: Per quanto riguarda i doppi strati planari, è importante disporre di SUV di alta qualità per una robusta formazione di doppi strati. La tabella 1 elenca il volume delle perle da una soluzione di densità del 10% e i rispettivi volumi SLBB che vengono utilizzati per ottenere una superficie finale di 5 mm² per una gamma di diametri delle perline.
   1. Le microsfere di silice (dette anche perline) tendono a depositarsi e ad aggregarsi; per mescolare le perle e rompere eventuali cluster, agitare la bottiglia per 15 s, quindi fare il bagno sonicato per 1 minuto e vorticare di nuovo per 15 s.
   2. Miscelare il volume appropriato di perle (Tabella 1) con il volume corrispondente di SLBB e 10 μL di SUV da 5 mM in una provetta per microcentrifuga a bassa aderenza da 0,5 mL.
   3. Scuotere la miscela di perle e lipidi da un capo all'altro per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che questa incubazione venga eseguita su un rotatore per evitare la sedimentazione.
2. Preparare le camere su vetrini coprioggetti PEGilati
   nota: Per quanto riguarda i doppi strati planari, vengono utilizzate camere fatte in casa da provette PCR in plastica per supportare i volumi di reazione, ma altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone, possono funzionare altrettanto bene.
   1. Mentre le perle oscillano, scongelare un vetrino coprioggetti PEGilato a temperatura ambiente. Tagliare una provetta per PCR da 0,2 ml e incollarla al vetrino coprioggetti come descritto. Per vetrini da 24 mm x 50 mm, è possibile inserire fino a 10 camere su un vetrino.
      nota: Questo protocollo utilizza vetrini coprioggetti in vetro PEGilato da 24 mm x 50 mm preparati in anticipo. In breve, i vetrini coprioggetti vengono puliti accuratamente mediante sonicazione in acetone, metanolo e 3 M KOH. I vetrini coprioggetti vengono quindi funzionalizzati con n-2-amminoetil-3-amminopropiltrimetossisilano e legati covalentemente al mPEG succinimidil valerato. I vetrini coprioggetti PEGilati finiti vengono conservati sottovuoto a -80 °C. Mentre qui sono suggeriti vetrini coprioggetti in vetro PEGilato, altri mezzi di passivazione, come i metodi BSA o poli-L-lisina, possono essere efficaci.
3. Lavare via i lipidi in eccesso
   nota: Questo passaggio serve a rimuovere i SUV in eccesso ed eseguire uno scambio di buffer. Le perle vengono lavate 4 volte in totale con un tampone di pre-reazione (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). La Tabella 2 elenca le velocità di centrifuga in RCF per una gamma di diametri delle perline.
   1. Centrifugare le perline all'RCF designato per 30 s (Tabella 2). Se si utilizzano perline di più dimensioni, mantenerle a dondolo fino a quando non è il momento di essere lavate.
      nota: Non vale la pena sedimentare perle più grandi nello stesso giro di perle più piccole con la velocità di sedimentazione delle perle più piccola per risparmiare tempo. Ciò può far sì che le perline si attacchino l'una all'altra e compromettano l'integrità del doppio strato.
   2. Dopo la prima centrifuga, rimuovere 50 μl di surnatante e aggiungere 200 μl di PRB. Dopo la seconda e la terza centrifuga, rimuovere 200 μl e aggiungere 200 μl di PRB. Dopo la quarta centrifuga, rimuovere 200 μl e aggiungere 220 μl di PRB. Pipettare energicamente per ogni lavaggio.
      nota: Il volume finale di risospensione è diverso da quello dei lavaggi. Non agitare le perle dopo l'incubazione con i lipidi in quanto ciò può lasciare spazi vuoti nei doppi strati. Per evitare la sedimentazione durante il lavoro con le altre dimensioni delle microsfere o l'impostazione di altre parti del saggio, riposizionare le miscele di microsfere sul rotatore end-over-end.
4. Preparazione della reazione
   1. Se si esegue un test di competizione con perle di più dimensioni, creare una miscela 1:1 mescolando volumi uguali di ciascuna dimensione di perline. Quindi, mescolare 29 μl della miscela di microsfere desiderata (o di una singola perla) con 721 μl di tampone RXN.
      nota: È importante mescolare accuratamente le perle ad ogni passaggio con una pipetta per evitare densi grappoli di perline; Ciò si tradurrà in una distribuzione più uniforme del cordone e in un'accurata superficie totale.
   2. Miscelare 75 μL di perle diluite e 25 μL di proteine diluite in SSB nei pozzetti.
      nota: Gli autori in genere visualizzano complessi di settina di lievito a 1-50 nM.
   3. Se si misurano le septine allo stato stazionario, incubare a temperatura ambiente per 1 ora, quindi eseguire l'imaging mediante microscopia quasi TIRF o confocale.
      nota: Questa reazione è progettata per preservare l'area totale della superficie della membrana della reazione a 5 mm² e per produrre una condizione di reazione finale di 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% metilcellulosa e 1 mM BME.

Tabella 1: Volumi normalizzati di microsfere. Al fine di mantenere un'area superficiale uguale di ogni dimensione di perlina e di mantenere l'area superficiale totale della membrana coerente tra gli esperimenti, sono stati calcolati i volumi per ogni dimensione di perlina e il tampone che ha normalizzato l'area superficiale totale.

Diametro del tallone (μm)	Volume delle perle ben miscelate (μL)	Volume del tampone SLB (μL)	Volume dei SUV (μL)
6.46	8.94	61,1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65,6	10
0,96	1.33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69,6	10

Tabella 2: Velocità di sedimentazione per microsfere di diametro variabile. Per ogni diametro di perla, le velocità di sedimentazione minime mostrate sono state utilizzate per pellettare le perle per lavare via i liposomi non legati

Diametro del cordone (μm)	Velocità di sedimentazione (RCF)
0,31	4.5
0,54	4.5
0,96	2.3
3.17	0,8
5.06	0,3

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per PCR da 0,2 mL con tappo piatto, Naturale	Watson	137-211C (EX)
Provette da 0,5 mL a bassa aderenza	Stati Uniti d'America Scientific	1405-2600
Beta mercaptoetanolo (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	Codice A4612-25G
Coverglass per la realizzazione di vetrini coprioggetti PEGilati	Termo Scientifico	Codice 152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Vetro di copertura 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Uovo Liss Rodamina PE	Avanti Polar Lipids	810146
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Metilcellulosa 4000cp	Sigma-Aldrich	Codice: M052-100G
Mini centrifuga
Microsfere di silice non funzionalizzate	Laboratori Bangs, Inc.	Dipende dalla taglia: SS0200*-SS0500*	Silice in sospensione acquosa
Adesivo ottico	Norland Thorlabs	NOA 68	Adesivo flessibile per vetro o plastica
cloruro di potassio	VWR	0395-1kg
Bagno sonicatore	Branson	1510R-MT	Pulitore ad ultrasuoni Bransonic. 50-60 Hz. Uscita: 70W
Soia PI	Avanti Polar Lipids	840044
Centrifuga da tavolo	Eppendorf	Codice 22331
Lampada UV	Spettrolina	ENF-260C	115 Volt, 60 Hz, 0,20 AMPERE