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1. Coltura di cellule epiteliali corneali umane
- Coltiva HCEC immortalizzato in fiasche da 75 cm² rivestite di collagene con 20 ml di miscela F-12 (DMEM/F12) modificata di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: L'agitazione non è necessaria.
- Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni.
2. Preparazione delle celle per il test
- Dopo che le cellule sono quasi confluenti, rimuovere il terreno di coltura.
- Aggiungere 4-6 mL di soluzione di dissociazione cellulare a ciascun pallone da 75 cm². Incubare le cellule a 37 °C fino al distacco delle cellule (circa 20-30 minuti), controllando periodicamente al microscopio.
- Aggiungere 2-6 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS a ciascun pallone da 75 cm².
- Trasferire il contenuto del matraccio in una provetta da centrifuga da 50 mL.
- Centrifugare le cellule a 450-500 x g per 5 minuti. Estrarre il surnatante e risospendere le cellule in un terreno preriscaldato.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare il volume del terreno che contiene un totale di 1 x 105 celle.
- Aggiungere 1 x 105 cellule a ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 48 pozzetti. Aggiungere una quantità sufficiente di terreno al pozzetto in modo che il volume finale di terreno nel pozzetto sia di 0,5 mL di coltura DMEM/F12 con il 10% di FBS.
NOTA: Una formulazione lacrimale artificiale può causare citotossicità che può essere misurata da una diminuzione dell'attività metabolica dell'HCEC. La coerenza dei dati dipende dall'aggiunta dello stesso numero di HCEC a ciascun pozzetto durante la semina. La concentrazione di coltura consigliata per piastre da 48 pozzetti è 1 x 105. Poiché le cellule di mammifero possono depositarsi nella provetta da centrifuga dopo la risospensione, si raccomanda di risospendere frequentemente le cellule mediante agitazione durante la semina delle piastre con le cellule in modo che la sospensione cellulare abbia l'HCEC equamente distribuito.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
3. Nessun protocollo di essiccazione
- Procedura di controllo
- Dopo l'incubazione di 24 ore, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra.
- Trattare immediatamente con 150 μl di una formulazione di prova e di una soluzione di controllo dei terreni.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti.
- Rimuovere le soluzioni di prova dalle celle.
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione colorante metabolica al 10% per testare l'attività metabolica. Incubare le cellule per altre 4 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, rimuovere 100 μL di soluzione colorante metabolica da ciascun pozzetto e posizionare ogni 100 μL in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre fluorescenti (Tabella dei materiali). Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 540 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.
- Nessun protocollo di essiccazione (procedura di recupero)
- Ripetere i passaggi 3.1.1-3.1.4.
- Aggiungere 0,5 mL di terreno DMEM/F12 a ciascun pozzetto.
- Incubare una serie di colture per 18 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Rimuovere il terreno e aggiungere 0,5 mL di soluzione colorante metabolica al 10%. Ripetere i passaggi 3.1.6 e 3.1.7.