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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
Il sangue periferico umano deve essere ottenuto da donatori sani con il consenso informato e l'uso di campioni di sangue deve essere conforme alle linee guida approvate stabilite dai comitati di revisione. In questo studio, il protocollo per utilizzare il sangue umano è una dimostrazione dei risultati della citometria a flusso (Figura 1) e dei saggi ELISpot (Figura 2).
1. Isolamento e purificazione delle cellule B del sangue periferico umano
- Aspirare ~ 10 ml di sangue dalla vena cubitale mediana (nella fossa cubitale anteriore al gomito) in una provetta da 15 ml contenente K2EDTA (da 1,5 a 2,0 mg/ml di sangue) e capovolgere immediatamente la provetta più volte per prevenire la formazione di coaguli.
- Aggiungere 35 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (RBC) autoclavato (121 °C, 15 min) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 e 1 mM EDTA; pH 7,4) alla provetta contenente il campione di sangue fresco (≥ 3:1 vol/vol) e incubare a temperatura ambiente (RT) per non più di 5 min.
nota: La comparsa della trasmissione della luce attraverso il tubo indica il completamento della lisi dei globuli rossi.
- Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Assicurarsi che il pellet sia di colore bianco.
- Risospendere il pellet con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato autoclavato (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 e 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) e centrifugare come al punto 1.3.
- Scartare il surnatante, risospendere il pellet con 10 mL di terreno RPMI 1640 (integratori: 10% di siero fetale di vitello, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B e 2 mM di L-glutammina), quindi piastrare le cellule in una piastra di coltura di 10 cm (10 mL di sangue per piastra). Mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per 30 minuti.
- Agitare delicatamente il piatto di coltura alcune volte e posizionare il terreno di coltura (cellule in sospensione) in provette coniche di plastica da 15 ml. Scartare le cellule aderenti (per lo più macrofagi) sui piatti di coltura.
- Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet con 1 mL di terreno RPMI 1640. Contare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
nota: La vitalità dei leucociti isolati è normalmente superiore al 90% per esclusione del blu di tripano.
- Centrifugare come al punto 1.7 e risospendere le cellule in ~ 200 μL di tampone PBS freddo (0,5% albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA) alla concentrazione di 5 - 10 x 106 cellule/mL.
- Aggiungere 5 μL di cocktail di anticorpi umani biotinilati specifici per le cellule del sangue (per la selezione negativa delle cellule B) per 10-6 cellule e incubare su ghiaccio per 30 min.
nota: Il cocktail anti-Ab umano dovrebbe includere almeno Abs specifici per CD2 (o CD3), CD14 e CD16.
- Aggiungere un volume in eccesso di 10 volte di PBS sterile alle cellule, centrifugare a 600 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere quantità uguali di microsfere coniugate con streptavidina (5 μl per 10-6 cellule) al pellet e mescolare accuratamente.
- Incubare con ghiaccio per 30 minuti in una provetta conica di plastica da 15 mL.
- Aggiungere 2 mL di tampone PBS nella provetta.
- Posizionare la provetta in un supporto magnetico e incubare a RT per 8 minuti. Le microsfere marroni si attaccheranno gradualmente alla parete del tubo accanto al magnete.
- Con la provetta rimasta nel supporto magnetico, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta sterile da 15 ml.
- Ripetere i passaggi da 1.14 a 1.16 e combinare i due surnatanti che contengono le cellule B intatte. Scartare le microsfere.
- Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet nel mezzo RPMI 1640 per esperimenti a valle.
nota: Tipicamente, è possibile isolare da 1 - 5 x 105 cellule B con una purezza superiore al 95% da 10 mL di sangue periferico.
2. Purificazione e separazione della memoria e delle cellule B naive da cellule B isolate
- Utilizzare le cellule purificate dal passaggio 1 e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
- Risospendere le cellule in 100 μL di tampone PBS freddo dopo la centrifugazione a 600 x g e RT per 5 minuti.
- Aggiungere 1 - 2 μg di mAb CD27 biotinilato per 106 cellule e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
- Aggiungere 10 mL di tampone PBS alla provetta e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
- Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 50 μL di tampone PBS.
- Aggiungere quantità uguali di microsfere magnetiche di streptavidina (1 - 2 μg/106 cellule) alle cellule in una provetta conica di plastica da 15 mL.
- Mescolare delicatamente e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
- Aggiungere 2 - 3 mL di tampone PBS alla provetta.
- Posizionare la provetta in un supporto magnetico e incubare a RT per 8 minuti per consentire alle microsfere marroni di attaccarsi al lato più vicino al magnete.
- Con la provetta inserita nel supporto magnetico, trasferire con cura la frazione surnatante in una nuova provetta sterile. Questa frazione contiene le cellule B CD27-naive arricchite.
- Aggiungere 5 ml alla provetta contenente le microsfere e risospendere delicatamente le microsfere (cioè la frazione arricchita di cellule B di memoria CD27+).
- Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Risospendere i pellet con il terreno RPMI 1640 per gli esperimenti a valle.
nota: Tipicamente, ~ 30 - 60% delle cellule B può essere purificato come cellule di memoria CD27+ dalle PBMC di un donatore sano.
3. Smistamento delle Cellule per la Raccolta di Cellule B Naive, Cellule B di Memoria e PB/PC
- Utilizzando le cellule purificate dalla fase 1, determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
- Risospendere le cellule in tampone PBS freddo alla concentrazione di 10,7 per mL in una provetta di polistirene da 5 mL.
- Aggiungere 1 - 2 μg di IgG umane per 106 cellule e incubare su ghiaccio per 10 minuti per il blocco Fc.
- Aggiungere 1 μg ciascuno di anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) e anti-CD38-PE (clone: HIT2) per 10-6 cellule; mescolare bene e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
- Negli ultimi 5 minuti al punto 3.4, aggiungere 5 μL della 7-amminomicina D commerciale (7-AAD).
- Aggiungere 2 mL di PBS alla provetta, agitare e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
- Risospendere le cellule nel tampone di selezione (PBS sterile con 2% BSA e 2 mM EDTA) a una concentrazione di 1 - 5 x 107 cellule per mL in una provetta da 15 mL.
- Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a rete di nylon (dimensione dei pori di 40 μm) per eliminare i grumi cellulari.
- Separare le cellule con un selezionatore citofluorimetrico dotato di tre laser: viola (405 nm), blu (488 nm) e rosso (640 nm).
nota: Il laser blu da solo è sufficiente per la citometria a flusso a 3 colori.
- Dividere le cellule in tre provette da 15 ml (contenenti 5 ml di terreno RPMI) per la raccolta simultanea di cellule B naive (CD19+CD27-), cellule B di memoria (CD19+CD27+) e PB/PC (CD19+CD27+/hiCD38+).
nota: Le cellule B naive e di memoria selezionate possono essere coltivate come descritto nel passaggio 4.
4. Differenziazione in vitro di cellule B CD19+ umane isolate, cellule B di memoria CD19+CD27+ e cellule B naive CD19+CD27
- Utilizzando le cellule purificate nei passaggi 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
- Risospendere le cellule con il terreno RPMI 1640 a una concentrazione di 1 - 10 x 105 per mL e aliquotarle nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.
- Aggiungere CpG (ODN 2006) a 5 μg/106 cellule/mL.
- Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 5 giorni.
- Raccogliere le cellule da ciascun pozzetto, posizionarle separatamente in provette da 15 ml, aggiungere 5 ml di PBS a ciascuna provetta e centrifugarle a 600 x g e RT per 5 minuti.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 - 10 x 105 per mL con terreno RPMI 1640.
5. Saggio ELISpot
- Aggiungere 30 μL di etanolo al 35% in acqua distillata a ciascun pozzetto delle piastre ELISpot per 30 s.
nota: Durante il pipettaggio, evitare sempre di toccare la membrana nei pozzetti.
- Capovolgere le piastre ELISpot per rimuovere l'etanolo.
- Mettere 150 μL di ddH2O autoclavato in ciascun pozzetto e incubarli a RT per 5 minuti per eliminare l'etanolo residuo; seguire con un lavaggio di PBS sterile a RT per 3 minuti
nota: I passaggi da 5.1 a 5.3 possono essere facoltativi, a seconda della produzione delle piastre.
- Mettere 50 μL di frammento policlonale F(ab')2 da 5 μg/mL di Ig anti-umane (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in ciascun pozzetto delle piastre ELISpot e incubarle a 4 °C durante la notte (preferibile) o a 37 °C per 2 ore.
nota: Sigillare i bordi delle piastre con Parafilm fino al momento dell'uso.
- Capovolgere le piastre per rimuovere gli Abs non legati, aggiungere 200 μL di PBS a ciascun pozzetto e incubarle due volte a RT per 3 minuti ogni volta.
- Aggiungere 200 μl di PBS con il 5% di BSA (o terreno RPMI 1640) a ciascun pozzetto per il blocco e incubarli a RT per 2 ore.
- Capovolgere le piastre per rimuovere il tampone di bloccaggio. Lavare ogni pozzetto due volte con 200 μL di PBS, come al punto 5.5.
- Aggiungere 100 μl di terreno RPMI 1640 a ciascun pozzetto e incubarli a 37 °C.
- Quando sei pronto per seminare le cellule, capovolgi le piastre per rimuovere il terreno RPMI 1640.
- Seminare 100 μL (5 x 104), 50 μL (2,5 x 104) e 25 μL (1,25 x 104) delle cellule (dai passaggi 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 e 4.6) nei pozzetti di una piastra ELISpot. Con il terreno RPMI 1640, portare il volume a 150 μL/pozzetto.
nota: Si raccomanda un minimo di una o due diluizioni seriali a 2 volte per la placcatura delle cellule.
- Incubare le piastre in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% per 8 - 14 ore. Evitare di spostare le piastre durante l'incubazione.
- Capovolgere le piastre per rimuovere le celle e il terreno RPMI 1640.
- Aggiungere 200 μL/pozzetto di PBS-T (PBS con 0,05% di Tween 20) e incubarli 5 volte a RT, ogni volta per 3 minuti. Capovolgere la piastra per rimuovere il tampone di lavaggio tra ciascuno dei 5 lavaggi.
- Aggiungere la fosfatasi alcalina IgG umana di capra (AP), gli Abs specifici per Fcγ (per la rilevazione delle IgG, 1:5.000 in PBS-T) o le IgM-AP umane anti-capra, gli Abs specifici per il frammento di Fcμ (per la rilevazione delle IgM, 1:5.000 in PBS-T) nei pozzetti designati e incubare a RT per 2 ore al buio.
- Lavare ogni pozzetto due volte con 200 μL di PBS, come al punto 5.5.
- Aggiungere 50 μL/pozzetto di soluzione di substrato di bromocloroindolil fosfato-nitro blu tetrazolio (BCIP/NBT). Le macchie di colore viola compaiono normalmente in 5-15 minuti.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di ddH2O per prevenire lo sviluppo eccessivo di macchie.
- Sciacquare le piastre con acqua corrente del rubinetto dopo il completo sviluppo di tutte le macchie.
- Rimuovere lo scarico inferiore delle piastre e lasciarle asciugare all'aria al buio.
- Contare gli spot utilizzando un lettore automatico di piastre con un'unità di acquisizione/analisi delle immagini (ad esempio, uno scanner automatico o manualmente tramite un microscopio da dissezione).
nota: Le lastre possono essere conservate presso RT al buio e analizzate in seguito.
