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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Crescita e preparazione di inoculi batterici
- Scongelare le scorte di glicerolo di Helicobacter pylori (H. pylori) o H. felis a partire da -80 °C e sottocoltura su piastre di agar sangue di cavallo (HBA) comprendenti: Blood Agar Base No.2 (vedi Tabella dei Materiali); un "integratore selettivo antibiotico di Skirrow" modificato (costituito da vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL; trimetoprim, 5 μg/mL; amfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5-10% (v/v) di sangue di cavallo. I batteri crescono bene in condizioni microaerobiche in barattoli anaerobici da 2,5 o 3,5 L contenenti le apposite confezioni di gas (vedi Tabella dei materiali), a 37 °C.
NOTA: I ceppi di H. pylori cresciuti in queste condizioni devono essere sottocoltivati dopo 1-1,5 giorni di incubazione, mentre per H. felis sono generalmente necessari almeno 2 giorni di incubazione. I terreni di coltura e di conservazione adatti sono stati descritti in dettaglio in precedenza.
- Preparare inoculi batterici per l'infezione del topo da colture in fase logaritmica precoce-media. Raccogli delicatamente i batteri dalle piastre di agar inondando ciascuna piastra con 1-2 ml di brodo di infuso di cuore cerebrale (BHI). Aspirare le sospensioni dalle piastre con le pipette Pasteur.
- In alternativa, preparare gli inoculi dei batteri Helicobacter che sono stati propagati nel brodo BHI per 16-18 ore. In questo caso, raccogliere i batteri mediante centrifugazione a bassa velocità a 2.200 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Valutare la vitalità e la motilità dei batteri esaminando le preparazioni a montaggio umido al microscopio a contrasto di fase (obiettivo 100X). Preparare le montature bagnate risospendendo un anello di batteri in una gocciolina da 10-20 μl di brodo BHI su un vetrino da microscopio. Nel caso di H. felis, che è un batterio molto più grande di H. pylori, utilizzare un emocitometro per contare con precisione il numero di batteri vitali. Confermare la purezza della coltura eseguendo una colorazione di Gram.
nota: Utilizzare gli inoculi di H. pylori solo se la maggior parte dei batteri ha una forma bacillare o a spirale (la morfologia può variare a seconda del ceppo). Gli inoculi di H. felis dovrebbero contenere principalmente batteri di forma elicoidale.Non usare inoculi se la maggior parte dei batteri ha una morfologia coccoide, poiché queste forme non sono vitali e non stabiliscono un'infezione nei topi.
- Stimare il numero di batteri nell'inoculo contando al microscopio a contrasto di fase il numero approssimativo di batteri per campo (obiettivo 100X) e utilizzando la seguente guida: 1 batterio per campo = circa 106 unità formanti colonie (CFU) di Helicobacter/mL; 10 batteri per campo = circa 107 CFU/mL; 100 batteri per campo = circa 108 CFU/mL, and so on.
- Quando si utilizza un emocitometro, calcolare CFU/mL utilizzando la seguente formula:
UFC/mL = (numero medio di batteri in un campo 4 x 4) x (fattore di diluizione) x (104).
- Regolare la densità delle cellule batteriche dell'inoculo a circa 107-10 8 CFU/mL mediante diluizione in brodo BHI, se necessario.
- Per garantire la massima vitalità batterica, utilizzare gli inoculi per la sonda gastrica il prima possibile dopo la preparazione.
- Confermare sempre la densità e la vitalità delle cellule di H. pylori eseguendo un conteggio vitale degli inoculi immediatamente dopo la procedura di sonda gastrica (vedere di seguito). Questo non è sempre possibile per H. felis, poiché di solito non forma colonie isolate sui terreni di coltura. Il numero di Helicobactervitali negli inoculi non può essere determinato dalla sola misurazione della densità ottica (A600) poiché questo metodo non discrimina tra batteri vitali (cioè bacillari/spirali/elicoidali) e non vitali (cioè coccoidi).
- Utilizzare i valori di densità ottica come mezzo per stimare il numero di batteri H. pylori vitali negli inoculi, ma in questo caso è prima necessario generare una curva di crescita. A tal fine, i valori A600 delle colture di H. pylori sono monitorati nel tempo e correlati direttamente con il numero di batteri vitali, determinati mediante conteggio su piastra.
nota: Un metodo conveniente per eseguire tali determinazioni della curva di crescita consiste nel coltivare i batteri in un mezzo liquido (Sezione 1.2), utilizzando fiasche standard di coltura tissutale a fondo piatto poste in un incubatore al 10% di CO2. Il numero di CFU, determinato dalle aliquote delle colture ottenute ogni 4-6 ore per 2-3 giorni, viene quindi confrontato con i corrispondenti valori A600. È importante sottolineare che le curve di crescita devono essere generate per ogni ceppo di H. pylori, poiché queste possono crescere a ritmi diversi e, inoltre, non tutti i ceppi crescono bene con il 10% di CO2.
2. Sonda intragastrica di topi con Helicobacter
NOTA: Questo metodo di sonda gastrica può essere applicato ad altre specie batteriche che colonizzano l'intestino, ad esempio S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Usa topi maschi o femmine di 6-8 settimane, privi di agenti patogeni specifici (SPF) e privi di Helicobacter. Utilizzare animali con un background genetico C57BL/6 per esperimenti di infezione da H. pylori o H. felis. Nel presente studio, abbiamo utilizzato topi wild-type (WT) e C57BL/6 geneticamente modificati privi di un recettore immunitario innato chiave (denominati animali knock-out o KO).
nota: Topi di altri background genetici possono essere utilizzati anche per le infezioni da Helicobacter, tuttavia, i livelli di colonizzazione e la gravità della malattia possono essere influenzati dal tipo di background dell'ospite.
- Aspirare l'inoculo batterico (passaggio 1.5) in siringhe monouso da 1 ml e sostituire gli aghi in dotazione con aghi da 23 gauge su cui sono fissati cateteri monouso in polietilene (lunghezza, 6-8 cm; diametro interno, 0,58 mm). Fissare i cateteri agli aghi mediante l'applicazione di piccole strisce di pellicola di plastica (vedi Tabella dei materiali). In alternativa, sostituire il gruppo ago/catetere utilizzando tubi di alimentazione sterili in plastica (20 gauge x 38 mm).
- Trattengono fisicamente i topi con una presa salda sulla collottola e sulla coda.
nota: Questa procedura può essere eseguita senza anestesia o, in alternativa, con l'uso di un anestetico per via inalatoria, come il metossiflurano o l'isoflurano.
- Inserire il catetere al centro della mascella aperta e guidarlo in direzione caudale verso l'esofago. Estendere il collo del topo per consentire un facile accesso allo stomaco attraverso l'esofago (e lontano dalla trachea) fino a quando la maggior parte o tutto il catetere non è più visibile e si avverte resistenza, corrispondente alla base dello stomaco. Erogare un'aliquota specifica, solitamente 100 μl per inoculazione (Figura 1).
nota: I topi devono essere sottoposti a gavaging con ≥ 105 CFU per garantire una colonizzazione ottimale e la patologia della malattia.
