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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sintesi SPIO-MtbsAb
- Sintetizzare la 2,2'-(etilendiossi)bisetilammina (EDBE) coniugata con SPIO utilizzando i metodi precedentemente riportati.
- Sintetizzare l'anidride succinica SPIO-EDBE (SA).
- Agitare una soluzione alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) di SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 μmol) a temperatura ambiente per 24 ore.
- Dializzare la soluzione con 20 cambi di 2 L di acqua distillata utilizzando un tubo a membrana porosa molecolare (cutoff 12.000-14.000 MW). 6 ore per ogni cambio.
- Infine, aggiungere 100 μL di SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL di Fe) a 400 μL di 4,5 mg/mL di anticorpo di superficie Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) per sintetizzare SPIO-MtbsAb utilizzando l'1-idrossibenzotriazolo e l'esafluorofosfato di tripirrolidinofosfonio (benzotriazol-1-ilossi) e agitare la soluzione a temperatura ambiente per 24 ore.
- Infine, separare le soluzioni dall'anticorpo non legato mediante cromatografia di filtrazione su gel.
- Caricare la miscela di reazione (5 mL) su una colonna di 2,5 cm × 33 cm ed eluire utilizzando un tampone salino tamponato con fosfato (PBS). Confermare il complesso Ab-nanoparticelle (cioè nanosonda) utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico.
2. Osservazione della morfologia delle particelle e misurazione del livello di rilassamento
- Esamina la dimensione media delle particelle, la morfologia e la distribuzione dimensionale utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a una tensione di 100 kV.
- Versare la dispersione composita su una griglia di rame da 200 mesh e asciugarla all'aria a temperatura ambiente prima di caricarla sul microscopio.
- Misurare i valori del tempo di rilassamento (T1 e T2) delle nanosonde utilizzando il rilassometro NMR a 20 MHz e 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Calibrare il relaxometro prima di ogni misurazione.
- Registrare i valori r1 e r2 dagli otto punti dati generati attraverso il recupero dell'inversione e la sequenza di impulsi di Carr-Purcell-Meiboom-Gill, rispettivamente, per determinare le rilassabilità r1 e r2.
3. Imaging cellulare
- Coltivare monociti umani THP-1 in RPMI 1640 con il 10% di siero fetale bovino, 50 μg/mL di gentamicina solfato, 100 unità/mL di penicillina G sodica, 100 μg di streptomicina solfato e 0,25 μg/mL di fungizone in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
- Incubare le nanosonde SPIO-MtbsAb (2 mM) con 106 unità formanti colonie (CFU) di Mycobacterium bovis BCG preincubate con 1 × 107 monociti attivati in provette da microcentrifuga (1 mL) in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora.
- Centrifugare le provette a 200 x g e scartare il surnatante. Risciogliere i pellet nel terreno (200 μl).
- Scansione dei campioni utilizzando una sequenza di impulsi di eco a gradiente veloce (tempo di ripetizione (TR) = 500; Tempo di eco (TE) = 20; Angolo di ribaltamento = 10°) attraverso la risonanza magnetica 3.0-T per determinare la specificità e la sensibilità della nanosonda.
4. Inoculazione di BCG (Bacillus Calmette–Guérin)
- Ricostituire il vaccino liofilizzato o il brodo batterico nel terreno di Sauton e quindi diluire il brodo con soluzione fisiologica fino a quando non si disperde correttamente come descritto in precedenza.
- Inoculare un ceppo vivo attenuato di M. bovis BCG, ottenuto da ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (ceppo Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) ad un volume di 0,1 mL/topo (cioè 10-7 CFU) per via intradermica nella pelle scapolare dorsale sinistra o destra dei topi, come descritto in precedenza. Iniettare soluzione salina nei topi come controllo negativo. Monitorare quotidianamente gli animali dopo l'inoculazione di BCG.
- Sacrificare gli animali 1 mese dopo l'inoculazione dei batteri utilizzando l'eutanasia con anidride carbonica. Raccogliere il tessuto dal sito di inoculazione intradermica. Fissare il tessuto in formalina al 10% e incorporarlo in paraffina per sezioni seriali a 5-10 μm. Colorare le sezioni di tessuto con le coloranti ematossilina/eosina e Ziehl-Neelsen per i batteri acido-resistenti e con il blu di Berlino per il ferro ferrico.
5. Risonanza magnetica in vivo
- Iniettare ketamina (80 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea nei topi per l'anestesia animale.
- Iniettare le sonde SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) nelle vene della coda dei topi. Topi con immagine RM prima e immediatamente dopo l'iniezione della sonda e poi ogni 5 minuti per 30 minuti per acquisire immagini spin-echo veloci pesate in T2 (TR = 3000; TE = 90; campo visivo = 8).
- Analizza quantitativamente tutte le immagini RM utilizzando l'intensità del segnale (SI), una misura di regioni di interesse definite in posizioni comparabili di un centro di granuloma Mtb e del muscolo posteriore adiacente a un'area granulomatosa.
- Calcolare i miglioramenti del segnale relativo utilizzando la misurazione SI prima (SIpre; controllo) e 0-3 ore dopo (SIpost) l'iniezione degli agenti di contrasto utilizzando la formula
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
dove SIpre è il SI della lesione nella scansione pre-potenziata e SIpost è il SI della lesione nella scansione post-potenziata.