Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Raccolta di pellet fecali freschi
- Preparare tovaglioli di carta sterili, pinze smussate e provette coniche da 50 ml.
- Mettere alcuni tovaglioli di carta e pinze in sacchetti per autoclave separati e sterilizzarli in autoclave a 180 °C a calore secco per 30 minuti. Utilizzare anche tubi conici sterili. Pesare i tubi conici e annotare il loro peso sui tubi.
- Accendi la cabina di biosicurezza nella stanza degli animali.
- Prendi una gabbia per topi pulita autoclavata senza lettiera e mettila nella cabina di biosicurezza. Rimuovere il coperchio e la griglia per alimenti e posizionarli all'interno del mobile.
- Metti dei tovaglioli di carta sterili sul fondo della gabbia e riposiziona la griglia di metallo sopra la gabbia.
- Identificare i donatori fecali di età corrispondente e posizionare la gabbia per topi nella cabina di biosicurezza. Apri la gabbia e afferra delicatamente un topo donatore (C57BL/6J) per la coda e posizionalo sulla rastrelliera di metallo sopra la gabbia pulita.
- Posiziona il coperchio della gabbia sopra la griglia e attendi che l'animale defechi.
NOTA: Metti contemporaneamente alcuni topi sulla cucciolata.
- Raccogliere i pellet fecali e metterli in una provetta conica sterile da 50 ml. Raggruppa i pellet per sesso. Non mescolare pellet fecali raccolti da maschi e femmine.
- Pesare nuovamente il tubo e calcolare il peso dei pellet fecali.
2. Preparazione della sospensione fecale
- Preparare una soluzione sterile (10% di glicerolo in soluzione fisiologica).
- Aggiungere 10 ml di glicerolo al 10%/soluzione fisiologica normale alla provetta conica per ogni grammo di pellet fecale.
NOTA: Se necessario, aumentare il volume della soluzione a 20 ml. Questo studio ha utilizzato anche 1 mL di soluzione per ogni pellet (5-10 mg).
- Omogeneizzare la miscela a bassa velocità con un omogeneizzatore da banco o un frullatore all'interno di una cappa aspirante per risospendere le feci (3 X 30 s).
- Filtrare la sospensione fecale attraverso 2 strati di garza di cotone sterile (10,2 cm x 10,2 cm). Conservare temporaneamente il filtrato in frigorifero per un massimo di 6 ore o confezionarlo in fiale criogeniche sterili e conservarlo in un congelatore a -80 °C.
- Pulire accuratamente l'omogeneizzatore o il frullatore seguendo una procedura standard.
3. Somministrazione di sospensione fecale mediante sonda gastrica orale
- Scongelare la sospensione fecale congelata con ghiaccio se si utilizzano campioni congelati. Mescolare la sospensione fecale scongelata mediante vortex.
- Trasferire la sospensione fecale fresca o scongelata in siringhe da 1 mL.
NOTA: Ogni topo riceverà un totale di 200 μL di sospensione fecale e ogni topo IL-10-/- nel gruppo di controllo riceverà 200 μL di glicerolo al 10%/soluzione fisiologica.
- Pesare i topi e scegliere la giusta dimensione dell'ago della sonda gastrica e il volume massimo di dosaggio.
NOTA: Per i topi con un peso corporeo compreso tra 20 e 25 grammi, utilizzare un ago per gavage curvo da 20 G 3,81 cm con una sfera da 2,25 mm. Si prega di controllare gavageneedle.com per ulteriori informazioni.
- Testare l'ago della sonda gastrica misurando la lunghezza dalla punta del naso del topo al processo xifoideo (parte inferiore dello sterno). Riempire la siringa con glicerolo/soluzione fisiologica al 10% o sospensione fecale e rimuovere le bolle d'aria all'interno della siringa e dell'ago.
NOTA: Se l'ago è più lungo della lunghezza, lasciare un segno sull'asta/tubo dell'ago a livello del naso. Non far passare l'ago/tubo attraverso l'animale oltre quel punto per evitare la perforazione gastrica.
- Posizionare una gabbia per mouse nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il coperchio della gabbia di plastica e lasciare il rack di metallo in posizione.
- Afferra un mouse per la coda e mettilo sulla rastrelliera di metallo. Tieni il topo per la coda con una mano e usa il pollice e il medio di un'altra mano per trattenere l'animale afferrando la pelle sopra le spalle. In questo modo, le zampe anteriori sono distese lateralmente, il che impedirà alle zampe anteriori di spingere fuori l'ago. Estendi delicatamente la testa dell'animale all'indietro e tieni la testa in posizione con una mano.
NOTA: Esercitarsi a maneggiare il mouse fino a quando lo sperimentatore non ha piena sicurezza prima di procedere con l'esperimento.
- Posiziona l'ago della sonda gastrica sopra la lingua all'interno della bocca. Avanzare delicatamente lungo il palato superiore fino a quando l'ago raggiunge l'esofago. Passa l'ago senza intoppi in un solo movimento. Non forzare l'ago se si avverte resistenza. Togli l'ago e riprova.
- Una volta che l'ago è posizionato e verificato correttamente, somministrare lentamente il materiale spingendo la siringa attaccata all'ago. Non ruotare l'ago né spingerlo in avanti, poiché potrebbe rompere l'esofago. Dopo il dosaggio, estrarre delicatamente l'ago.
- Rimetti il topo nella sua gabbia di casa. Monitora l'animale per 5-10 minuti cercando segni di respirazione affannosa o angoscia. Monitorare nuovamente i topi tra le 12 e le 24 ore dopo l'FMT.
