Una tecnica di co-coltura per differenziare le cellule progenitrici neurali umane in neuroni

Abstract

Fonte: Su, C. T. E., et al. Un approccio optogenetico per valutare la formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra un metodo per differenziare le cellule progenitrici neurali umane (NPC) in neuroni. Le NPC vengono introdotte in una co-coltura di neuroni corticali di topo e ratto, promuovendo la differenziazione delle NPC nei neuroni. La differenziazione è confermata dalla visualizzazione delle cellule al microscopio confocale.

Protocollo

1. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte

1. Coltura di fibroblasti umani in DMEM integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in piastre a 6 pozzetti.
2. Prima di iniziare la riprogrammazione dei fibroblasti, rivestire i 6 pozzetti con Matrigel e incubare per almeno un'ora a temperatura ambiente. All'80% di confluenza, rimuovere il terreno dalle colture di fibroblasti e lavare una volta con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Aggiungere una quantità sufficiente di tripsina-EDTA allo 0,25% per coprire l'intera piastra e incubare a 37 °C per 10 minuti.
4. Una volta che le cellule si sono staccate dai pozzetti, aggiungere il doppio della quantità di DMEM con il 10% di FBS rispetto a quella della tripsina per spegnere la digestione della tripsina. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rompere le cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro.
5. Trasferire 7 x 10⁵ cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti.
6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in una soluzione di elettroporazione. Elettroporare i fibroblasti secondo le istruzioni del produttore. Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di elettroporazione e aggiungere 1 μg di ciascun vettore episomiale. Celle elettroporate con impostazioni di 1.650 V, 10 ms e 3 impulsi temporali.
7. Trasferire la sospensione cellulare nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS e piastra 5 x 10⁴ celle per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO₂.
8. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno dalle colture di fibroblasti trasfettate e sostituirlo con il terreno mTeSR. Sostituire quotidianamente i terreni di coltura fino a quando le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) non sono pronte per essere isolate. Le colonie di iPSC possono essere osservate dopo 28-35 giorni.
9. Quando è pronto per l'isolamento, tagliare meccanicamente una colonia di iPSC e riseminarla in terreno mTeSR con un inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) da 10 μM (Y-27632) su una piastra a 6 pozzetti rivestita da Matrigel. Sostituire il terreno di coltura ogni giorno.

2. Induzione neurale e mantenimento di NPC umani

1. Quando le colture di iPSC sono circa il 20% di confluenza, rimuovere il terreno mTeSR e sostituirlo con un terreno di induzione neurale. Reintegrare il mezzo ogni due giorni.
2. Dopo 7 giorni, rimuovere il mezzo di induzione neurale e sostituirlo con un mezzo di mantenimento NPC umano. Rifornire il terreno ogni due giorni fino a 7 giorni prima di passare le colture.
3. Prima di passare le colture, rivestire le piastre/fiasche con Matrigel a temperatura ambiente per almeno un'ora.
4. Rimuovere i terreni dalle colture NPC umane confluenti e lavare una volta con 1x PBS, quindi aspirare il PBS.
5. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per il distacco delle cellule a coprire tutti i pozzetti, quindi incubare per 5 minuti a 37 °C.
6. Assicurarsi che tutte le celle siano state staccate. Aggiungere ai pozzetti/fiasche la quantità di DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) rispetto a quella della soluzione di distacco cellulare.
7. Trasferire le cellule contenenti DMEM/F-12 in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
8. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di terreno di mantenimento NPC umano. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rompere le cellule.
9. Placcare un terzo delle cellule totali in pozzetti/fiasche di coltura rivestite Matrigel e rabboccare un terreno sufficiente integrato con 10 μM di Y-27632. Incubare i recipienti di coltura a 37 °C e 5% di CO₂.
   1. Dividi le colture 1:3 ogni 3 o 4 giorni e reintegra il terreno a giorni alterni. Mantieni le colture NPC umane ad alta densità per prevenire la differenziazione.

3. Differenziazione di NPC umani in neuroni in co-culture

1. Aggiungere il vettore lentivirale Synapsin1-tdTomato alla coltura di NPC umana prima di iniziare la differenziazione in neuroni. Preparare le co-colture di astrociti/neuroni corticali con un giorno di anticipo prima di differenziare le NPC umane.
2. Lavare una volta le colture di NPC umane con 1x PBS e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di distacco cellulare a coprire tutti i pozzetti/fiasche, quindi incubare per 5 minuti a 37 °C.
3. Assicurarsi che tutte le celle siano state staccate. Aggiungere il doppio della quantità di DMEM/F-12 di quella della soluzione di distacco cellulare ai pozzetti/fiasche. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di terreno di differenziazione neuronale. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rompere il pellet cellulare in singole cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro.
5. Aspirare con cura il terreno da colture di astrociti/neuroni corticali. Piastra di NPC umane a 5 x 10³ cellule/cm² in 500 μl di terreno di differenziazione neuronale integrato con 10 μM di Y-27632 per ogni 24 pozzetti. Aggiungere delicatamente terreno contenente NPC umane in ogni pozzetto per evitare di disturbare gli astrociti e i neuroni corticali.
6. Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO₂. Sostituire metà del terreno con terreno fresco ogni due o tre giorni per almeno 28 giorni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di riprogrammazione iPSC episomiale Epi5	Invitrogen	Codice A15960
DMEM/F12	Lonza	Codice 12719F
Matrigel	BD Bioscienze	354277
Terreno neurobasale	Invitrogen	21103049
Bsa	sigma	Codice: A7906
Pbs	Termo Scientifico	SH30028.02
Provetta da centrifuga da 15 ml	BD Bioscienze	352096
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200056
Provetta da centrifuga da 50 ml	BD Bioscienze	Codice 352070
Piastre a 24 pozzetti	Corning	9761146
Piastre a 6 pozzetti	Corning	720083
Palloni T25	Corning	430641
Sistema di trasfezione al neon	Invitrogen	MPK5000	Per l'elettroporazione di fibroblasti umani
Fibroblasti umani dermici normali	PromoCell	Codice: C12300
pLenti-Sinapsina-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE	Addgene	Codice 20945