Imaging del calcio in singoli neuroni che regolano il comportamento di deposizione delle uova in Caenorhabditis elegans

Abstract

Fonte: Ravi, B. et al., Imaging raziometrico del calcio di singoli neuroni nel comportamento di Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica per l'imaging del calcio nei singoli neuroni di Caenorhabditis elegans che si comportano utilizzando proteine reporter fluorescenti geneticamente codificate. Delinea i passaggi coinvolti nell'imaging del movimento dei vermi e nella misurazione dei rapporti di fluorescenza del reporter dai neuroni per correlare i livelli intracellulari di calcio con l'attività neuronale e i cambiamenti comportamentali durante la deposizione delle uova.

Protocollo

1. Varietà, Terreni Culturali e Montaggio di Animali

1. Coltiva i vermi C. elegans a 20 °C su piastre di agar standard da 60 mm con terreno di crescita per nematodi (NGM) seminate con cibo batterico OP50 E. coli.
2. Preparare due plasmidi per ogni promotore specifico della cellula di interesse: uno, che guida l'espressione di GCaMP5 per registrare il Ca²⁺ intracellulare, e il secondo, che guida l'espressione di mCherry per consentire la quantificazione raziometrica dei cambiamenti di fluorescenza di GCaMP5 e semplificare la ricerca e la misurazione degli oggetti><. nota: GCaMP5:mL'imaging raziometrico Cherry corregge le fluttuazioni della fluorescenza GCaMP5 che derivano da cambiamenti nella messa a fuoco e nel movimento degli animali, non da cambiamenti effettivi nel Ca²⁺ intracellulare.
3. Iniettare plasmidi che esprimono GCaMP5 e mCherry insieme al plasmide marcatore di salvataggio visibile pL15EK nelle gonadi di animali mutanti LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X e recuperare animali non-Muv lin-15(+) che esprimono GCaMP5 e mCherry da un transgene ad alta copia. Usa lo sfondo mutante lite-1 per ridurre il comportamento di evitamento della luce blu.
4. Integrare i transgeni nei cromosomi per ridurre il mosaicismo e semplificare la generazione di ceppi mutanti composti.
   nota: Il ceppo LX2004 qui descritto trasporta un transgene integrato ad alta copia che esprime GCaMP5 e mCherry nelle HSN dal promotore nlp-3 (vedi Tabella dei Materiali). È stato scoperto che il promotore nlp-3 guida una forte espressione nelle HSN di L4 tardiva e di animali adulti senza causare difetti significativi nello sviluppo di HSN o nel comportamento di deposizione delle uova rispetto ad altri promotori testati (ad esempio, tph-1, egl-6 e unc-86). Questo ceppo e altri che esprimono GCaMP5 e mCherry nei motoneuroni del cordone ventrale (VC), nei muscoli vulvari e nelle cellule neuroendocrine uv1 sono disponibili presso il Caenorhabditis Genetics Center e sono stati descritti i dettagli della loro costruzione.
5. Applicare il cibo batterico OP50 da una piastra di agar NGM seminata sul fondo di un plettro di verme di platino e utilizzarlo per trasferire ~ 20 animali tardivi L4 LX2004 che esprimono GCaMP5 e mCherry nelle HSN dal promotore nlp-3. Assicurati che la vulva in via di sviluppo appaia in uno stereomicroscopio come una macchia scura chiara circondata da una mezzaluna bianca. Incubare gli animali a 20 °C per 24-40 h.
6. Dopo l'incubazione, applicare OP50 sul plettro e trasferire ~ 3 dei vermi su una piastra NGM non seminata, lasciando una piccola quantità di cibo per i vermi di cui nutrirsi durante l'imaging. Assicurati cibo a sufficienza, poiché troppo poco cibo batterico incoraggerà i vermi ad allontanarsi dal centro del piatto, mentre troppo cibo aumenterà la fluorescenza di fondo e causerà ipossia.
7. Utilizzare una spatola piatta e arrotondata per tagliare un pezzo di ~ 20 mm x 20 mm dalla piastra che trasporta i vermi e trasferire il pezzo a faccia in giù al centro di un vetrino coprioggetti pulito da 24 mm x 60 mm #1.5 (Figura 1). Avviare l'applicazione da un lato per evitare che le bolle rimangano intrappolate sotto il vetrino coprioggetti e interferiscano con l'imaging. Applicare un vetrino coprioggetti #1 da 22 mm x 22 mm sulla parte superiore del pezzo per ridurre l'adesione e l'evaporazione.

2. Configurazione dell'hardware e della strumentazione

1. Posizionare i vermi transgenici in stadi sul tavolino di un microscopio invertito con un obiettivo ≥ 0,7 Numerical Aperture Plan-Apochromat 20x, tavolino XY motorizzato controllabile con un joystick, uno splitter di immagini e filtri a fluorescenza per l'eccitazione e l'emissione simultanea di GCaMP5 e mCherry, telecamere per l'imaging a fluorescenza e a infrarossi in campo chiaro e un sistema di illuminazione a diodi a emissione di luce (LED) attivabile (Figura 2A).
   NOTA: Un divisore di fascio 80/20 invia l'80% del segnale dell'immagine alla telecamera a fluorescenza e il 20% alla telecamera a campo chiaro. È possibile utilizzare anche un microscopio verticale, ma in questo caso il pezzo NGM deve essere posizionato tra un vetrino e il vetrino coprioggetti grande.
   1. Utilizzare gli oculari binoculari per selezionare un verme per l'imaging. Quando viene selezionato un animale, far scorrere il filtro a infrarossi in posizione sopra il condensatore.
2. Trigger logici transistor-transistor (TTL)
   1. Collegare i cavi coassiali da ciascuna delle tre linee di uscita del trigger TTL sulla telecamera a fluorescenza. Collegare la prima uscita all'ingresso BNC #3 del sistema di illuminazione a LED.
   2. Collegare la seconda uscita a un adattatore BNC "banana" con fili verde e marrone dal connettore GPIO a 8 pin che corre rispettivamente all'ingresso GPIO #3 (pin 4) e alla terra (pin 5) della termocamera.
   3. Collegare la terza uscita a un adattatore BNC a "banana" con ponticelli che vanno all'ingresso digitale #8 e alla messa a terra del dispositivo di acquisizione digitale (Figura 2B).
3. Dispositivo di acquisizione digitale (DAQ)
   1. Collegare la scheda del microcontrollore DAQ (vedere la tabella dei materiali) al PC tramite un cavo USB. Aggiorna il firmware con il protocollo standard Firmata (vedi Tabella dei Materiali) e configura la porta USB per comunicare a 57600 baud.
4. Led
   1. Eseguire il software LED Controller (vedere la Tabella dei materiali). Cambia la modalità di trigger da "Continuo" a "Gated" e seleziona il canale di trigger "3" per entrambi i LED da 470 e 590 nm.
   2. Accendere e inserire l'alimentazione del LED per ciascun LED (ad esempio, impostare il LED da 470 nm al 20% e il LED da 590 nm al 40%).
5. Esegui lo script di comunicazione in fase seriale 'XY-stage-final' in Bonsai (vedi Tabella dei materiali). Fare clic sul nodo grigio 'CsvWriter' e selezionare una cartella per salvare le informazioni sulle fasi X e Y registrate (Figura 3). Premere la freccia verde nella barra degli strumenti per inizializzare il DAQ.
   nota: Lo script inizierà a registrare la posizione del palco X e Y quando la telecamera a fluorescenza invia un segnale TTL. Questo script restituisce quattro colonne di dati: numero di fotogramma, posizione X (μm), posizione Y (μm) e intervallo tra i fotogrammi (s).
6. Nel software di registrazione della telecamera a infrarossi (vedere la Tabella dei materiali), in "Modalità video personalizzate", selezionare "Modalità 1" (binning 2 x 2; 1.024 x 1.024 pixel) e "Formato pixel Raw 8". In "Trigger / Strobe", impostare la linea di ingresso del trigger (GPIO) su "3", la polarità su "High" e la "Mode" su "14". Attiva o disattiva "Abilita" per interrompere l'acquisizione del frame fino a quando non viene ricevuto un segnale di trigger TTL.
   1. Lasciando aperta la finestra, fai clic sul pulsante rosso "Registra" sulla barra degli strumenti principale della vista della telecamera. Selezionare la cartella in cui salvare le sequenze di immagini. Selezionare la modalità di registrazione "Bufferizzata" e salvare le "Immagini" in formato JPEG. Fare clic su "Avvia registrazione" per inizializzare l'acquisizione.
7. Telecamera a fluorescenza e splitter di immagini
   nota: I canali di fluorescenza GCaMP5 e mCherry devono essere raccolti contemporaneamente per garantire una corretta registrazione dell'immagine per la quantificazione raziometrica. Uno splitter di immagini consente l'acquisizione a due canali della fluorescenza GCaMP5 e mCherry su un unico sensore.
   1. Nella scheda "Acquisizione" del software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali), impostare il tempo di esposizione su 10 ms, il binning su 4x e la profondità dell'immagine su 16 bit. Selezionate una sottoserie di fotocamere centrate di 512 pixel di larghezza per 256 pixel di altezza. Fai clic su "Mostra opzioni trigger output" e imposta tutti i trigger su "Positivo
      NOTA: Il DAQ può occasionalmente perdere i trigger TTL se sono pari o inferiori a 10 ms.
   2. Assicurati che "Trigger 1" e "Trigger 2" siano impostati su "Esposizione" mentre "Trigger 3" sia impostato su "Programmabile" con un "Periodo" di 25 ms. Nella scheda "Sequenza", selezionare "Time Lapse" con un "Ritardo di campo1" di 50 ms per raccogliere immagini a 20 Hz. Selezionare "Salva in buffer temporaneo".
8. Guadagno PMT e intensità laser durante l'imaging confocale a tre canali
   1. Impostare il guadagno PMT in modo che la fluorescenza di fondo sia a un livello appena superiore al minimo (livello del nero). Aumentare la potenza del laser a 561 nm (verde) fino a quando non si osserva un singolo pixel saturo a 12 bit o 16 bit all'estremità presinaptica nel canale mCherry.
   2. Regolare l'intensità del laser a 488 nm (blu) in modo che la fluorescenza GCaMP5 sia appena visibile all'estremità presinaptica sopra lo sfondo. Questa impostazione bassa impedisce la saturazione dei pixel GCaMP5 quando la fluorescenza aumenta in risposta a forti transitori di Ca²⁺. Apri completamente il foro stenopeico confocale per massimizzare la cattura della luce.

3. Imaging raziometrico Ca²⁺ e registrazione del comportamento

1. Nella scheda "Sequenza" del software di acquisizione della fluorescenza, fare clic su "Avvia" per iniziare la registrazione. Segui il verme con il joystick, mantenendo le cellule e le sinapsi di interesse a fuoco e al centro del campo visivo (FOV). Fai clic sul pulsante "Statistiche" nella finestra dell'istogramma per mostrare le statistiche dei pixel di ciascun canale.
2. Regolare la potenza del LED per garantire una fluorescenza mCherry massima a pixel singolo all'estremità presinaptica di ≥ 8.000 conteggi (~ 4.000 fotoelettroni), fornendo una gamma dinamica di ~ 12 bit sopra lo sfondo (~ 100 fotoelettroni). I segnali GCaMP5 all'estremità presinaptica durante il riposo (basso) Ca²⁺ dovrebbero essere intorno a ~ 2.500 conteggi - appena visibili sopra lo sfondo.
3. Registrare fino a raggiungere uno stato attivo di deposizione delle uova; in genere, questo si verifica ogni 20-30 minuti in un verme di tipo selvatico. Salva un sottoinsieme di 10 minuti (12.001 fotogrammi), 6.000 fotogrammi prima e dopo il primo evento di deposizione delle uova (fotogramma 6.001). Assicurarsi di mantenere lo stesso sottoinsieme di immagini in campo chiaro del comportamento del verme e dei punti temporali della posizione dello stadio XY, altrimenti la sincronizzazione precisa dei flussi di dati andrà persa.
4. Utilizzare ImageJ e il plug-in BioFormats (vedere Tabella dei materiali) per convertire le sequenze di immagini nel formato Image Cytometry Standard (.ics) in modo che possano essere importate nel software Ratiometric Quantitation.

Risultati

Figura 1. Tecnica di montaggio di C. elegans per l'imaging ad alta risoluzione dell'attività e del comportamento del circuito di deposizione delle uova.In alto, l'attacco finale di lato. In basso, la montatura finale vista attraverso la parte inferiore del grande vetrino coprioggetti. Le frecce indicano il cibo batterico OP50, i vermi C. elegans e le uova, inseriti ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Crescita, coltivazione e montaggio di C. elegans
Ceppo batterico di Escherichia coli, OP50	Centro genetico Caenorhabditis	OP50	Cibo per C. elegans. Uracil, auxotrofo. E. coli B. Biosicurezza Livello 1
HSN GCaMP5+mCeppo di verme ciliegia	Centro genetico Caenorhabditis	LX2004	Transgene integrato che utilizza il promotore nlp-3 per guidare l'espressione di GCaMP5 e mCherry in HSN. Genotipo completo: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Ceppo mutante LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) per la preparazione di transgeni	autore	LX1832	Ceppo per il recupero di transgeni ad alto numero di copie dopo microiniezione con plasmide di salvataggio pL15EK lin-15(n765ts). Porta anche la mutazione lite-1 (ce314) collegata che riduce la sensibilità alla luce blu. Disponibile presso l'autore su richiesta
pL15EK lin-15a/b plasmide genomico di salvataggio	autore	pL15EK	Plasmide di salvataggio per il recupero di animali transgenici dopo iniezione in LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) ceppo X. Disponibile presso l'autore su richiesta
Plasmide pKMC299	autore	pKMC299	Plasmide per l'espressione di mCherry nelle HSN dal promotore nlp-3. Ha nlp-3 3' regione non tradotta
Plasmide pKMC300	autore	pKMC300	Plasmide per l'espressione di GCaMP5 nelle HSN dal promotore di nlp-3. Ha nlp-3 3' regione non tradotta
Fosfato di potassio monobasico	sigma	P8281	Per la preparazione di piastre NGM
Fosfato di potassio bibasico	sigma	P5655	Per la preparazione di piastre NGM
Solfato di magnesio eptaidrato	Amresco	662	Per la preparazione di piastre NGM
Cloruro di calcio diidrato	Alfa Aesar	Codice: 12312	Per la preparazione di piastre NGM
peptone	Becton Dickinson	Codice 211820	Per la preparazione di piastre NGM
cloruro di sodio	Amresco	241	Per la preparazione di piastre NGM
colesterolo	Alfa Aesar	Codice A11470	Per la preparazione di piastre NGM
Agar, Batteriologico Tipo A, Ultrapuro	Affymetrix	Codice 10906	Per la preparazione di piastre NGM
Piastre di Petri da 60 mm	VWR	Codice 25384-164	Per la preparazione di piastre NGM
Occhiali Micro Cover 24 x 60 mm, #1.5	VWR	48393-251	Vetro di copertura attraverso il quale vengono ripresi i vermi
Occhiali Micro Cover 22 x 22 mm, #1	VWR	Codice 48366-067	Vetro di copertura che copre la parte superiore del pezzo di agar
Stereomicroscopio con base a luce trasmessa	Leica	M50	Microscopio da dissezione per il mantenimento, la stadiazione e il montaggio della deformazione di viti senza fine
Filo di platino iridio, (80:20), 0,2 mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	Per il trasferimento di worm
Microscopio per immagini di calcio
Tavolo d'aria antivibrante	Catalogo TMC	63-544	Tavolo da laboratorio Micro-g' Tavolo antivibrante da 30" x 48" con CleanTop M6 da 4" su piano da 25 mm
Microscopio composto invertito	Zeiss	Numero 431007-9902-000	Microscopio invertito Axio Observer.Z1
Sideport L80/R100 (3 posizioni)	Zeiss	Numero 425165-0000-000	Per deviare il 20% dell'output verso la telecamera a campo chiaro (CMOS) e l'80% verso la telecamera a fluorescenza (sCMOS)
Supporto per illuminazione inclinabile all'indietro	Zeiss	Numero 423920-0000-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamento
Alloggiamento lampada 12V/100W con collettore	Zeiss	Numero 423000-9901-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamento
Lampada alogena 12V/100W	Zeiss	Codice 380059-1660-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamentale. I LED a luce bianca non emettono una luce infrarossa significativa, quindi non consentiranno l'imaging in campo chiaro dopo il filtro passa-banda a infrarossi
Filtro passa-banda infrarosso da 32 mm (750-790 nm) per lampada alogena	Zeiss	Numero 447958-9000-000	BP 750-790; DMR 32mm, per illuminazione a infrarossi per campo chiaro e comportamento
Torretta del condensatore a 6 filtri (LD 0,55 h/DIC/ph), motorizzata	Zeiss	Numero 424244-0000-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamento
Condensatore e otturatore	Zeiss	Numero 423921-0000-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamento
Oculare binoculare con fototubo per fotocamera CMOS a infrarossi	Zeiss	Numero 425536-0000-000	Per l'imaging a infrarossi/comportamento
Oculare 10x, 23mm	Zeiss	444036-9000-000	Per la localizzazione del verme sul pezzo di agar
Adattatore C-Mount 2/3" 0,63x	Zeiss	Numero 426113-0000-000	Supporto per telecamera CMOS a infrarossi
Telecamera CMOS per campo chiaro e comportamento a infrarossi (sensore da 1")	FLIR (precedentemente Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Fotocamera per l'imaging in campo chiaro
Scheda controller host USB 3.0	FLIR (precedentemente Point Grey Research)	ACC-01-1202	Fresco FL1100, 4 porte
8 pin, cavo GPIO da 1 m, connettore circolare Hirose HR25	FLIR (precedentemente Point Grey Research)	ACC-01-3000	Cavo per l'attivazione TTL. Il filo verde si collega a GPIO3 / Pin 4 e il filo marrone si collega a Terra / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0,8 WD=0,55 M27	Zeiss	Numero 420650-9901-000	Migliore combinazione di ingrandimento, apertura numerica e distanza di lavoro
Torretta riflettore a 6 cubi, motorizzata	Zeiss	Numero 424947-0000-000	Per l'imaging a fluorescenza
Treno di luce a fluorescenza, motorizzato	Zeiss	Numero 423607-0000-000	Per l'imaging a fluorescenza
Otturatore a fluorescenza	Zeiss	Numero 423625-0000-000	Per l'imaging a fluorescenza
Cubo filtro a doppia eccitazione ed emissione GFP e mCherry (per microscopio)	Zeiss	Numero 489062-9901-000	Set di filtri FL 62 HE BFP+GFP+HcRed per imaging a fluorescenza
Sistema di illuminazione a LED	Zeiss	Numero 423052-9501-000	Sistema LED Colibri.2 attivabile per illuminazione fluorescente
Modulo LED GFP (470 nm)	Zeiss	Numero 423052-9052-000	LED Colibri.2 per eccitazione a fluorescenza GFP
Modulo LED mCherry (590 nm)	Zeiss	Numero 423052-9082-000	Colibri.2 LED per eccitazione a fluorescenza mCherry
Cursore di arresto del diaframma per apparecchiature a luce incidente	Zeiss	000000-1062-360	Diaframma dell'apertura di campo per limitare l'illuminazione a LED al campo visivo della fotocamera
Adattatore C-Mount 1" 1.0x	Zeiss	Numero 426114-0000-000	Adattatore per splitter di immagini e fotocamera a fluorescenza sCMOS
Splitter di immagini	Hamamatsu	Codice A12801-01	Gemini W-View, altri splitter di immagini possono essere utilizzati, ma potrebbero non essere ottimizzati per le grandi dimensioni del sensore delle fotocamere sCMOS
Specchio dicroico GFP / mCherry (splitter di immagini)	Semrock	Di02-R594-25x36	Divisione di GCaMP5 da mCherry e segnali a infrarossi
Filtro di emissione GFP (splitter di immagini)	Semrock	FF01-525/30-25	Cattura della fluorescenza GCaMP5
mCherry/ filtro di emissione (splitter di immagini)	Semrock	FF01-647/57-25	Questo filtro è necessario per escludere la luce infrarossa utilizzata per l'imaging in campo chiaro
Fotocamera sCMOS per fluorescenza (sensore da 1")	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. I modelli più recenti consentono impostazioni di acquisizione delle immagini separate su metà separate del sensore, consentendo l'acquisizione di immagini a due canali in combinazione con uno splitter di immagini
Stadio XY motorizzato	Märzhäuser	SCANSIONE IM 130 x 100	Movimento dello stadio; la risoluzione XY di questo stadio è di 0,2 μm per passo
Controllore da palco XY con joystick	LUDL	MAC6000, joystick XY	Tracciamento manuale dei vermi. MAC6000 controller deve essere collegato al PC tramite la porta seriale (RS-232) configurata a 115200 baud
Scheda di acquisizione digitale (DAQ)	Arduino	ONU	Ricezione di trigger TTL dalla fotocamera sCMOS. L'Uno deve essere caricato con il pacchetto standard Firmata e la porta USB del computer configurata a 57600 baud
Cavo da BNC maschio a BNC maschio - 6 piedi	Tecnologia Hosa	HOBB6	Connettori BNC per il trigger TTL
Cavo coassiale BNC maschio a SMA maschio placcato oro (8,8")	UXCELL	6.08642E+11	Per collegare le uscite trigger della telecamera a fluorescenza
Adattatore per testa girevole BNC	Hantek	RRBNCTH21	Adattatore da BNC a spina a banana (4 mm)
Connettore BNC femmina-femmina	Diageng	20130530009	Adattatore BNC femmina-femmina per collegare l'uscita BNC dalla fotocamera alla spina a banana
Fili flessibili per ponticelli breadboard senza saldatura	Z&T	GK1212827	Per collegare le uscite trigger BNC al DAQ Arduiono. Da maschio a maschio.
Postazione di lavoro ad alte prestazioni	CV	Z820	Windows 7, 64 GB di RAM, processore Dual Xeon, unità C: a stato solido, porta seriale (RS-232), più slot PCIe3 per connettività Ethernet, schede USB 3.0 e unità a stato solido aggiuntive
Unità a stato solido M.2	S.r.	MZ-V5P512BW	Streaming e analisi ad alta velocità dei dati delle immagini
Adattatore per unità a stato solido M.2 per workstation	Lycom	DT-120	Adattatore da M.2 a PCIe 3.0 a 4 corsie
Archiviazione collegata alla rete	Synologia	DS-2415+	Archiviazione e analisi dei dati di imaging
Unità disco rigido	Digitale occidentale	WD80EFZX	ROSSO 8 TB, 5400 giri/min Classe SATA 6 Gb/s 128 MB di cache 3,5 pollici. Archiviazione dei dati di imaging (10 unità + 2 unità di ridondanza)
software
Acquisizione della fluorescenza	Hamamatsu	HCImage DIA	Registrazione di sequenze di immagini a fluorescenza a due canali (GCaMP5 e mCherry) a 20 fps
Acquisizione in campo chiaro	FLIR (precedentemente Point Grey Research)	Cattura mosche	Registrazione di sequenze di immagini JPEG in campo chiaro
Lettore di porta seriale da palco	bonsai	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Facilita il tracciamento dei vermi durante il comportamento
Software di controllo LED	Zeiss	Test Micro Toolbox 2011	Per impostare l'intensità e gli ingressi di trigger per i diversi LED nell'unità Colibri.2
ImmagineJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Semplice revisione delle sequenze di immagini e delle modifiche di formattazione per l'importazione nel software di quantificazione raziometrica
eccellere	Valentina	Codice 2002984-001-000001	Per la generazione di sottoinsiemi di dati con valori separati da virgole da Volocity per l'analisi MATLAB
Rilevamento del picco	MATLAB	R2017a	Script utilizzato per i calcoli della funzione di picco del rapporto
Quantificazione raziometrica	Perkin Elmer	Volocity 6,3	Facilita il calcolo dei canali dell'immagine raziometrica, la segmentazione dell'immagine per la ricerca di oggetti e la misurazione del rapporto degli oggetti trovati
Script
AnalyzeGCaMP_2017.m	MATLAB	Script del rapporto medio e del centroide XY	Analizza un output raziometrico in formato .csv, consolidando oggetti e posizioni del centroide, calcolando le variazioni di rapporto (ΔR/R), identificando picchi e caratteristiche di picco e scrivendo grafici (con e senza picchi annotati) in formato postscript. Per l'importazione del file matrice, lo script emetterà i dati in tre cartelle: analizzati, picchi e tracce. L'output 'analizzato' è un file matrice degli oggetti consolidati con sei colonne (unità): tempo (s), area (micron quadrati), rapporto, baricentro X (micron), baricentro Y (micron) e ΔR/R. L'output 'Picchi' è un file matrice dei punti temporali dei picchi trovati, l'ampiezza (in ΔR/R), l'ampiezza del picco (s), e l'importanza della vetta. L'output 'Traces' è costituito da file postscript di tracce di calcio.
XY-stage-final.bonsai	bonsai	DAQ attivato da TTL e lettore di porta seriale per la posizione dello stadio	Registra la posizione dello stadio X e Y (in micron) quando l'Arduino collegato riceve un segnale TTL positivo dalla fotocamera sCMOS durante l'esposizione del fotogramma. Lo script scrive un file .csv con quattro colonne: numero di fotogramma, posizione X (micron), posizione Y (micron) e il tempo trascorso tra i fotogrammi (in genere ~50 msec quando si registra a 20 fps). Le posizioni dello stadio X e Y da questo output (colonne 2 e 3, rispettivamente) vengono aggiunte alle posizioni del centroide X e Y da AnalyzeGCaM