Registrazione delle oscillazioni della banda gamma dai neuroni del nucleo peduncolopontino in una fetta di cervello

Abstract

Fonte: Urbano, F. J., et al. Registrazione delle oscillazioni della banda gamma nei neuroni del nucleo peduncolopontino. J. Vis. (2016).

Il video mostra il metodo per registrare le oscillazioni della banda gamma nei neuroni PPN. Utilizzando una sezione sagittale del cervello con bloccanti sinaptici in aCSF, impiega impulsi di corrente positiva tramite una pipetta di cerotti per aprire i canali del calcio, inducendo un'attività sottosoglia cruciale per la veglia.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del liquido cerebrospinale artificiale standard (aCSF)

1. Preparazione della soluzione madre A
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata in un becher pulito da 1 litro prima di aggiungere prodotti chimici.
   2. Mescolando continuamente un volume di 500 ml, aggiungere 136,75 g di NaCl, 6,99 g di KCl, 2,89 g di MgSO₄ e 2,83 g di NaH₂PO₄.
   3. Aggiungere altra acqua distillata fino a raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ciascun composto è 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄ e 1,18 mM NaH₂PO₄.
   4. Conservare in frigorifero a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Preparazione della soluzione madre B
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata in un becher pulito da 1 litro prima di aggiungere prodotti chimici.
   2. Mescolando continuamente un volume di 500 ml, aggiungere 41,45 g di D-glucosio e 41,84 g di NaHCO₃.
   3. Aggiungere altra acqua distillata fino a raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ciascun composto è di 11,5 mM di D-glucosio e 24,9 mM di NaHCO₃.
   4. Conservare in frigorifero a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   5. Prima di ogni esperimento, miscelare 50 ml di brodo A con 50 ml di brodo B e portare a 1 litro con acqua distillata per ottenere la concentrazione finale di soluzione di aCSF e lasciare a RT ossigenandola continuamente con carbogeno (miscela 95% O₂ - 5% CO₂) per almeno 30 minuti. Preparare la concentrazione finale di aCSF solo all'inizio di ogni esperimento e scartare alla fine della giornata.

2. Preparazione del liquido cerebrospinale artificiale saccarosio (saccarosio-aCSF)

1. Preparazione della soluzione madre C
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata in un becher pulito da 1 litro prima di aggiungere prodotti chimici.
   2. Mescolando continuamente 500 ml di acqua distillata, aggiungere 240 g di saccarosio, 6,55 g di NaHCO₃, 0,671 g di KCl, 4,88 g di MgCl₂, 0,22 g di CaCl₂ e 0,21 g di acido ascorbico.
   3. Aggiungere altra acqua distillata fino a raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ciascun composto è 701,1 mM di saccarosio, 78 mM di NaHCO₃, 9 mM di KCl, 24 mM di MgCl₂, 1,5 mM di CaCl₂ e 1,2 mM di acido ascorbico.
   4. Conservare la soluzione madre C a 4 °C per un massimo di una settimana.
   5. Prima di ogni esperimento, mescolare 300 ml di 50 ml di brodo C con 600 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di saccarosio-aCSF alla concentrazione finale. Lasciare in posa RT ossigenando continuamente con carbogeno (miscela 95% O₂ - 5% CO₂) per almeno 30 min.

3. Preparazione della fetta

1. Mettere un becher pulito con 100 ml di soluzione di saccarosio-aCSF nel ghiaccio ossigenandolo con carbogeno e fissare il pH a 7,4 utilizzando un pHmetro aggiungendo alcune gocce di soluzione di NaOH 0,1 M (quando pH < 7,4) o di soluzione HCl 0,1 M (quando pH > 7,4).
2. Riempire una camera di taglio di un vibratomo con saccarosio-aCSF e ossigenarlo. Accendere il sistema di refrigerazione a base di glicerolo accoppiato alla camera di taglio e attendere 15 minuti per farlo raffreddare a 0 - 4 °C.
3. Anestetizzare cuccioli di ratto (di età compresa tra 9 e 12 anni da ratti adulti Sprague-Dawley in gravidanza a tempo) con ketamina (70 mg/kg, i.p.; utilizzando < volume finale di 50 μl). Quando il cucciolo è calmo, ricontrolla che il riflesso di pizzicamento della coda sia assente.
4. Decapitare i cuccioli.
   1. Tagliare la pelle della testa longitudinalmente dalla parte anteriore a quella posteriore utilizzando una lama di bisturi in acciaio al carbonio e tirare la pelle ai lati con una pinza. Taglia l'osso che copre il cervello, muovi le forbici lateralmente e rimuovilo completamente per esporre il cervello.
   2. Quindi, rimuovere rapidamente il cervello utilizzando una spatola (inizialmente posta sotto il bulbo olfattivo per spingerlo delicatamente fuori dalle zone più rostrali verso quelle più caudali). Spingi delicatamente il cervello nel liquido cerebrospinale artificiale saccarosio ossigenato raffreddato con ghiaccio (saccarosio-aCSF).
5. Praticare un taglio parasagittale sull'emisfero destro (rimuovendo circa un terzo dell'emisfero) e incollare il lato rifilato del cervello su un disco metallico che verrà fissato magneticamente alla camera di taglio di un vibroslicer per tagliare sezioni sagittali di 400 μm contenenti il nucleo peduncolopontino (PPN). Conservare le sezioni PPN in RT per 45 minuti prima delle registrazioni con patch clamp a cella intera.

4. Registrazioni delle oscillazioni in banda gamma in fette PPN

1. Preparazione della soluzione intracellulare di potassio-gluconato (soluzione ad alto contenuto di K+)
   1. Mettere in ghiaccio un becher pulito con 10 ml di acqua distillata. Mescolando continuamente aggiungere: K+-gluconato, 90,68 mg di fosfocreatina di Tris sale, 47,66 mg di HEPES, 1,5 mg di EGTA, 40,58 mg di Mg²⁺-ATP e 4 mg di Na⁺_2-GTP.
   2. Regolare il pH a 7,3 con KOH (100 mM in acqua distillata). Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume finale di 20 ml. Se necessario, regolare l'osmolarità con saccarosio (100 mM in acqua distillata) a 280 - 290 mOsm. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ciascun composto è 124 mM di K+-gluconato, 10 mM di fosfocreatina di Tris sale, 10 mM di HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg²⁺-ATP e 0,3 mM Na⁺_2-GTP.
   3. Aliquotare le soluzioni intracellulari in provette da 1 ml e congelarle a -20 °C. Utilizzare un'aliquota al giorno e mantenerla a 4 °C durante gli esperimenti.
2. Registrazioni Patch Clamp a cella intera
   1. Porre le fette in una camera di immersione e perfonderle (1,5 ml/min) con aCSF ossigenato (95% O₂ - 5% CO₂) contenente i seguenti antagonisti del recettore: antagonista selettivo del recettore NMDA acido 2-ammino-5-fosfonovalerico (APV, 40 μM), antagonista competitivo del recettore del glutammato AMPA/Kainate 6-ciano-7-nitrochinossalina-2,3-dione (CNQX, 10μM), antagonista del recettore della glicina stricnina (STR, 10 μM), l'antagonista specifico del recettore GABA_A gabazina (GBZ, 10 μM) e il bloccante dei canali del sodio tetrodotossina (TTX, 3μM)
      Riempire le pipette per patch di registrazione (resistenza 2-7 MΩ; realizzate con capillari in vetro borosilicato a parete spessa regolari e disponibili in commercio con diametro esterno di 1,0 mm e diametro interno di 0,6 mm) con una soluzione intracellulare ad alto contenuto di K+ utilizzando riempitivi per pipette per patch disponibili in commercio con un filtro per soluzione. Inserire la pipetta nel supporto dell'amplificatore. Applicare una piccola pressione positiva utilizzando una siringa da 1 ml collegata al supporto della pipetta tramite un tubo in silicone collegato a una valvola a tre vie. Collegare la parte posteriore del portapipette a un amplificatore patch clamp.
   2. Spostare la pipetta di registrazione utilizzando un micromanipolatore meccanico vicino al nucleo PPN utilizzando un obiettivo 4X combinato con un'ottica di contrasto interferenziale differenziale nel vicino infrarosso.
      nota: Il nucleo di PPN può essere osservato in fette dorsali al peduncolo cerebellare superiore (SCP; osservabile come un fascio spesso di assoni). Le pipette di registrazione erano localizzate nella pars compacta della PPN, che si trova immediatamente dorsalmente all'estremità posteriore del peduncolo.
   3. Portare la pipetta di registrazione a contatto con un neurone PPN durante la visualizzazione utilizzando una lente a immersione in acqua 40X e applicare rapidamente l'aspirazione negativa per formare una tenuta con la cellula.
   4. Utilizzare il software di tenuta voltage-clamp per monitorare la resistenza della pipetta durante l'aspirazione negativa utilizzando il protocollo del produttore.
      1. Quando l'aspirazione negativa viene aumentata lentamente e i valori di resistenza letti dal monitor patch-clamp sulla punta della pipetta raggiungono 80 - 100 MOhm, modificare rapidamente il potenziale di mantenimento a -50 mV e rilasciare la pressione negativa. Iniziare ad applicare continuamente l'aspirazione negativa fino a quando non si rompe la membrana del neurone e si ottiene l'accesso elettrico nella configurazione dell'intera cellula.
      2. Se i valori della resistenza di accesso misurati dal software di tenuta voltage-clamp sono pari o superiori a 10 MOhm, continuare ad applicare l'aspirazione negativa in quantità minori.
   5. Compensare la capacità (cioè i transitori lenti e veloci osservati dopo la rottura della membrana della cella) e la resistenza in serie in modalità voltage-clamp. Cambia la modalità di registrazione sulla pinza amperometrica e compensa rapidamente i valori del ponte (ad esempio, sposta la manopola dell'amplificatore o fai clic sul menu di compensazione automatica utilizzando il mouse del computer).
      1. Monitora continuamente il potenziale di membrana a riposo del neurone PPN registrato utilizzando il protocollo del produttore. Se il potenziale di membrana a riposo si sposta verso valori depolarizzanti o iperpolarizzanti, utilizzare piccole quantità di corrente continua (fino a 100 pA) per mantenere il valore finale ottimale di -50 mV.
         nota: Mantenere iperpolarizzati solo i neuroni PPN con un potenziale di membrana a riposo stabile (RMP) di -48 mV o superiore (cioè RMP < -48 mV).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
saccarosio	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, peso molecolare = 342,30
bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, peso molecolare = 84,01
cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, peso molecolare = 74,55
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	Codice: M9272	MgCl2 · 6H2O, peso molecolare = 203,30
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C3881	CaCl2 · 2H2O, peso molecolare =147,02
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, peso molecolare = 180,16
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	Codice: A5960	C6H8O6, peso molecolare =176,12
cloruro di sodio	Acros Organics	327300025	NaCl, peso molecolare = 58,44
Gluconato di potassio	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, peso molecolare = 234,25
Fosfocreatina di(tris) sale	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, peso molecolare = 453,38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, peso molecolare = 238,30
EGTA	Sigma-Aldrich	E 0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, peso molecolare = 380,40
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, peso molecolare = 507,18
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idrato	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, peso molecolare = 523,18
Tetrodotossina citrato	Laboratori Alomone	T-550	C11H17N3O8, peso molecolare = 319,27
Acido DL-2-ammino-5-fosfonovalerico	Sigma-Aldrich	Codice: A5282	C5H12NO5P, peso molecolare = 197,13
CNQX sale disodico idrato	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, peso molecolare = 276,12
stricnina	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, peso molecolare = 334,41
Cloridrato di mecamilammina	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M9020	C11H21N · HCl, peso molecolare = 203,75
Gabazina (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, peso molecolare = 368,23
Cloridrato di ketamina	Mylan	Codice 67457-001-00
microscopio	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipolatore	Strumenti Sutter	ROE-200
Micromanipolatore	Strumenti Sutter	MPC-200
amplificatore	Dispositivi molecolari	Multiclamp 700B
Convertitore A/D	Dispositivi molecolari	Digidata 1440A
calorifero	Strumenti Warner	TC-324B
pompa	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Cartuccia della pompa	Cole-Parmer	Stampante Masterflex 7519-85
Estrattore per pipette	Strumenti Sutter	P-97
macchina fotografica	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratomo	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Sistema di refrigerazione	Strumenti a vibratomo	900R
attrezzatura
microscopio	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipolatore	Strumenti Sutter	ROE-200
micromanipolatore	Strumenti Sutter	MPC-200
amplificatore	Dispositivi molecolari	Multiclamp 700B
Convertitore A/D	Dispositivi molecolari	Digidata 1440A
calorifero	Strumenti Warner	TC-324B
pompa	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
cartuccia della pompa	Cole-Parmer	Stampante Masterflex 7519-85
estrattore per pipette	Strumenti Sutter	P-97
macchina fotografica	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C