L'uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Summary

Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

Abstract

Immagini dinamiche delle cellule vive permette la visualizzazione diretta in tempo reale delle interazioni tra le cellule del sistema immunitario ^{1, 2,} tuttavia la mancanza di controllo spaziale e temporale tra la cellula fagocitica e microbo ha reso focalizzato osservazioni sulle interazioni iniziale di risposta dell'ospite ad agenti patogeni difficili. Storicamente, gli eventi di contatto intercellulare come la fagocitosi ³ sono stati ripreso miscelando due tipi di cellule, e poi continuo la scansione del campo visivo per trovare serendipitous contatti intercellulari nella fase appropriata di interazione. La natura stocastica di questi eventi rende questo processo noioso, ed è difficile osservare gli eventi in anticipo o in fugace contatto cellula-cellula da questo approccio. Questo metodo richiede trovando le coppie di cellule che sono sul punto di contatto, e osservando loro fino a quando consumato il loro contatto, o non. Per far fronte a queste limitazioni, usiamo trapping ottico come un non-invasivo, il metodo non distruttivo, ma veloce ed efficace per posizionare le cellule in coltura.

Trappole ottiche o pinzette ottiche, sono sempre più utilizzati nella ricerca biologica per catturare e manipolare le cellule fisicamente e altri micron di particelle di dimensioni in tre dimensioni ^4. Pressione di radiazione è stato osservato e applicato ai sistemi pinzetta ottica nel 1970 ^{5, 6,} e fu usato per controllare campioni biologici nel 1987 ^7. Da allora, pinzette ottiche hanno maturato in una tecnologia per sondare una varietà di fenomeni biologici ^8-13.

Descriviamo un metodo ¹⁴ che avanza dal vivo imaging cellulare, integrando una trappola ottica con la filatura microscopia confocale disco con controllo di temperatura e umidità per fornire squisita controllo spaziale e temporale di organismi patogeni in un ambiente fisiologico per facilitare le interazioni con le cellule ospiti, come determinato dal operatore. Live, gli organismi patogeni come Candida albicans e Aspergillus fumigatus, che può causare potenzialmente letale, infezioni invasive nei soggetti immunocompromessi ^{15, 16} (ad esempio l'AIDS, chemioterapia, pazienti e organo trapianto), erano intrappolati otticamente con tecniche non distruttive intensità laser e si è trasferito adiacente al macrofagi, in grado di fagocitare l'agente patogeno. Alta risoluzione, filmati luce trasmessa e fluorescenza basato stabilito la capacità di osservare gli eventi iniziali della fagocitosi nelle cellule viventi. Per dimostrare l'applicabilità ampio in immunologia, primario cellule T sono stati intrappolati e manipolati per formare sinapsi con anti-CD3 microsfere rivestite in vivo, e time-lapse imaging di formazione di sinapsi è stato ottenuto. Fornendo un metodo per esercitare avere un controllo spaziale di agenti patogeni vivono rispetto alle cellule immunitarie, le interazioni cellulari possono essere catturate al microscopio a fluorescenza con perturbazione minima di cellule e può produrre una potente visione prime risposte dell'immunità innata e adattativa.

Protocol

1. Condizioni di coltura di agenti patogeni per l'intrappolamento ottico

1. Crescere A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) su un semi-solido agar contenente SBD (Sabouraud destrosio) 30 ° C per 3 giorni.
2. Crescere C. albicans (SC5314) in YPD (Lievito peptone destrosio) coltura liquida contenente 100 mg / ml ampicillina notte in un incubatore shaker a 30 ° C.

2. Preparazione di agenti patogeni per l'etichettatura fluorescente

1. Raccolta desiderata quantità di agenti patogeni e trasferire in una provetta 1,5 ml di reazione.
2. Aggiungere 300 ml di tampone fosfato (PBS) al tubo di reazione.

Discussion

In questo lavoro si usa una trappola ottica di catturare patogeni con dimensioni tra i 3 micron - 5 micron. Anche se gli agenti patogeni di interesse al nostro laboratorio hanno tipicamente queste dimensioni, il sistema di pinzetta ottica qui descritto è flessibile per intrappolare una vasta gamma di formati. In realtà le trappole ottiche sono stati utilizzati per catturare le particelle che vanno da singoli atomi alle cellule di circa 10 micron di diametro. Inoltre, questo sistema di intrappolamento ottico è in grado d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
A. fumigatus			Ceppo albino, B-5233/RGD12-8, dono di KJ Kwon-Chung, NIH
C. albicans			SSY50-B mutante, dono di Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 ceppo, dono di Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
dimetilformammide	Sigma	D4551
Sangue fresco			Dono di RJW Heath, MGH, HMS
Nikon microscopio invertito	Nikon		Modello Ti-E
Laser trapping, ChromaLase	Blue Sky di ricerca	CLAS-106-STF02-02
Eccitazione laser a fluorescenza	Coerente		Modello Innova 70C
Basette per i componenti cattura	Thorlabs	MB1224, MB1218
Ottica aria tavolo	Tecnico Manufacturing Corporation
Otturatore elettronico con comando a pedale	Uniblitz		Acquistato da Associates Vincent, Rochester, NY
Fibra ottica monomodale	Oz Ottica	PMJ-3S3S-1064-6
Fibra posizionatore	Thorlabs	PAF-X-5-C
Fibra collimatore	Oz Ottica	HPUCO-23-1064-P-25AC
Lenti per telescopio	Thorlabs	AC254-150-B	Lunghezza focale di 150 mm
Fasi di traduzione (x, y, z)	Newport	M-461-XYZ
IR specchio dicroico	Chroma	ET750-sp-2P8
Della lente dell'obiettivo (100X)	Nikon		NA = 1.49, immersione in olio, obiettivo TIRF
Testa confocale	Yokogawa	CSU-XI
Polarizzatore	Nikon	MEN51941
Prisma Wollaston	Nikon	MBH76190
EM-CCD	Hamamatsu	C9100-13
CCD (ORCA ER)	Hamamatsu	C4742-80-12AG
Ruota portafiltri	Ludl	99A353
Ruota portafiltri	Sutter	LB10-NWE
Chambered coprioggetti	Lab-Tek/Nunc	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Rivestiti con anti-CD3
Medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM)	Invitrogen / Gibco	10313
Penicillina / streptomicina	Invitrogen / Gibco	15140-122
L-glutammina	Invitrogen / Gibco	25030-081
Siero fetale bovino (Hyclone)	ThermoScientific	SH30071.03