Somministrazione sottocutanea di antagonisti muscarinici e Triple-immunocolorazione del lungo muscolo elevatore Auris in topi

Sommario

Si descrivono le modalità di somministrazione ripetuta di inibitori di segnalazione muscarinici a lungo del muscolo elevatore dell'ano Auris (LAL), muscolo di topi adulti giovani e per immunocolorazione successive delle sue giunzioni neuromuscolari (NMJs) in wholemounts. Il muscolo LAL ha vantaggi unici per rivelare In vivo Effetti farmacologici su NMJs.

Abstract

Muscoli dell'arto posteriore di roditori, come il gastrocnemio e tibiale anteriore, sono frequentemente utilizzati in vivo per studi farmacologici dei segnali indispensabili per la formazione e la manutenzione di NMJs mammiferi. Tuttavia, la penetrazione della droga in questi muscoli dopo somministrazione sottocutanea o intramuscolare è spesso incompleta o irregolare e NMJs molti possono rimanere inalterati. Sebbene la somministrazione sistemica con dispositivi come i mini-pompe in grado di migliorare gli effetti spazio-temporali, la natura invasiva di questo approccio può causare confusione risposte infiammatorie e / o danno muscolare diretto. Inoltre, l'analisi completa del NMJs in un muscolo dell'arto posteriore è impegnativo, perché richiede tempi lunghi sezionamento seriale e immunocolorazione estesa.

Il LAL mouse è un sottile foglio piatto di muscoli situati superficialmente sul dorso del collo. Si tratta di uno dei muscoli a contrazione rapida che funzioni per spostare il padiglione auricolare. Esso contiene porzioni rostrali e caudali che provengono dalla linea mediana del cranio e si estendono lateralmente alla porzione cartilaginea di ogni padiglione auricolare. Il muscolo è alimentato da un ramo del nervo facciale che i progetti caudalmente non appena esce dal forame stilo-mastoideo. Noi e altri hanno trovato LAL essere una preparazione conveniente che offre vantaggi per l'indagine sia a breve che a lungo termine in vivo gli effetti delle droghe sul NMJs e muscoli. In primo luogo, la sua posizione superficiale facilita molteplici applicazioni locali di farmaci in anestesia luce. In secondo luogo, la sua magrezza (2-3 strati di fibre muscolari) permette la visualizzazione e l'analisi di quasi tutti i NMJs all'interno del muscolo. In terzo luogo, la facilità di analizzarlo con la sua intatta nervo insieme con il modello della sua innervazione permette analisi elettrofisiologiche supplementari in vitro ^9,5. Ultimo, e forse più importante, un piccolo volume applicato (~ 50μl) copre facilmente l'intera superficie muscolare, fornisce una esposizione uniforme e prolungato di tutti i suoi NMJs al farmaco ed elimina la necessità di un approccio sistemico ^1,8.

Protocollo

1. Somministrazione sottocutanea di recettori muscarinici dell'acetilcolina (mAChR) antagonisti

1. Preparare in condizioni asettiche la dose appropriata di antagonista mAChR, (cfr. Tabella) dissolvendo il farmaco in soluzione fisiologica sterile in tubo di reazione 1,5 ml. Gli antagonisti sono stati utilizzati: atropina, Methoctramine, 4-UMIDO, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
2. Disegna 50μl di soluzione in siringa da insulina a1cc e utilizzare una siringa separato per ogni mouse. Anche preparare siringhe contenenti soluzione fisiologica solo per ogni mouse nel gruppo di controllo. Tenga le siringhe sul ghiaccio fino al momento di iniettare.
3. Anestetizzare topi con ketamina-xylazina cocktail (120 mg / kg di ketamina, 8 mg / kg xilazina) Verificare la presenza di adeguate profondità dell'anestesia, osservando la mancanza di risposta ai piedi pizzico.
4. Dopo la sedazione adeguata, radere i capelli che coprono la regione rostrale della testa nella regione caudale del collo, pulire i capelli rimanenti via con etanolo al 70%.
5. Topo posto sotto stereomicroscopio, e inserire l'ago parallelo al muscolo LAL mentre tirando leggermente l'ago della siringa (Fig. 1A, B). Questo assicura che l'ago viene inserito nel sovrastante tessuto connettivo e non danneggiare direttamente il muscolo LAL stesso. Inserire l'ago in modo che la punta copre l'aspetto caudale del muscolo LAL.
6. Molto lentamente cominciano a iniettare la soluzione sopra il muscolo destro LAL, mentre il ritiro della siringa, il tempo di iniezione totale dovrebbe essere di circa 1 minuto. Se iniettato correttamente, la soluzione deve formare una "cupola" che è di circa 1 cm di diametro, nella cute sovrastante che rimarrà per almeno un'ora. Una soluzione uniformemente iniettato coprirà l'intera regione rostrale e caudale del muscolo destro LAL.
7. Ripetere la procedura ogni 12 ore per 1 a 7 giorni. Per studi1 altri, abbiamo utilizzato lo stesso protocollo di iniettare fattori di crescita ogni 12 ore per un massimo di 21 giorni. Nessun risposte anomale sono state osservate dai topi somministrato con 2x anestesia al giorno per un massimo di 21 giorni.

2. Dissezione dei muscoli LAL

1. Euthanize topi con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (390 mg / kg). La morte è assicurata dalla valutazione della mancanza di battito cardiaco dopo toracotomia viene eseguita.
2. Fissare il mouse in un piatto da dissezione, lato dorsale con 1 pin in ogni zampa e 1 perno attraverso il naso.
3. Fare la prima incisione attraverso la pelle solo, usando le forbici per tagliare piccola sorgente lungo la LAL sinistra dalla regione prossimale solo per l'orecchio per la regione intorno alla scapola sinistra.
4. Rimuovere con cura la pelle in questa regione, ma non tagliare troppo vicino al orecchio destro come questo è uno dei punti di attacco per il muscolo destro LAL.
5. Individuare la posizione centrale striscia di tessuto adiposo di lipidi lungo la linea mediana, sulla superficie superficiale della testa, dove i muscoli destra e sinistra LAL si incontrano. Con forbici piccola sorgente, tagliato 1cm a destra del tessuto adiposo (verso l'orecchio sinistro) dal bordo prossimale del muscolo LAL sinistra fino a raggiungere la spalla (Fig. 1C).
6. Una volta che l'incisione è fatto, togliere il muscolo destro LAL con pinzetta per esporre la parte ventrale del muscolo. Tagliare il tessuto connettivo e della fascia, mentre con cura tirando il muscolo destro LAL con una pinza (Fig. 1C).
7. Tagliare intorno alla fine caudale della LAL diritto alla base dell'orecchio. Continuare a tagliare, verso la fine rostrale dell'orecchio destro, mantenendo il LAL destra capovolta (Fig. 1C).. E 'meglio includere più tessuto in questa fase che rischiare di danneggiare la stessa LAL. Se il muscolo comincia ad asciugarsi, pipetta 1X PBS sopra il muscolo.
8. Luogo sezionato diritto LAL nel piatto 30 millimetri cultura Sylgard contenente PBS 1X, lato dorsale alto. Fissare quattro angoli del muscolo con perni piccolo insetto.
9. Uso di pinze e forbici piccola primavera, pulito tessuto connettivo dalle superfici dorsale e ventrale del muscolo destro LAL. Girare muscolo sopra e ri-pin per pulire dalla superficie ventrale. 2-3 muscoli possono essere collocati nello stesso piatto 30mm.

3. Immunocolorazione tripla di NMJs LAL: Giorno 1

1. Prima dell'inizio immunostaining, preparare tutti i reagenti necessari. PBS 1X, 2% di albumina sierica bovina BSA) / PBS, 0,1 M glicina nel 2% BSA / PBS, X100 Triton 0,2% nel 2% BSA / PBS, e il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1X saranno necessari. Pre-cool metanolo in freezer -20 ° C.
2. Lascia muscoli LAL appuntato sul lato dorsale piatto durante questo processo. Scartare la soluzione PBS 1X e aggiungere abbastanza 4% (PFA) per coprire il muscolo. Piatto luogo il agitatore a velocità 2 o 3 per 20 minuti. Se non diversamente specificato, il piatto deve essere immesso in uno shaker per i passi successivi.
3. Eliminare 4% PFA e lavare il muscolo con PBS 1X 3 volte, 10 'ciascuno.
4. Eliminare ultimi PBS 1X lavare e aggiungere 0,1 M glicina nel 2% BSA / PBS soluzione per 30 '.
5. Scartare la soluzione 0.1M Glycine unod aggiungere 1X PBS contenente rodamina coniugato α-bungarotossina ad una concentrazione di 1:200 per 15 '.
6. Eliminare α-bungarotossina soluzione e lavare muscolare in PBS 1X, 3 volte 10 'ciascuno.
7. Permeabilize tessuto con l'aggiunta di pre-raffreddata metanolo e posizionare il piatto nel congelatore di -20 ° C proprio per 5 minuti, senza bisogno di agitazione.
8. Togliere il metanolo e lavare 3 volte 10 'ciascuno con PBS 1X. Eliminare ultimo lavaggio dei tessuti e blocco con 0,2% Triton X-100 nel 2% BSA / PBS per 1 ora. Le fasi di lavaggio e il blocco vengono eseguiti a temperatura ambiente.
9. Incubare i muscoli durante la notte, tremando, a 4 ° C in un cocktail di anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco (cfr. Tabella).

4. Immunocolorazione tripla di NMJs LAL: Giorno 2

1. Lavare i muscoli in PBS 1X 3 volte, 10 'ciascuno a temperatura ambiente.
2. Aggiungi cocktail di anticorpi secondari nel bloccare soluzione per 1 ora a temperatura ambiente (cfr. Tabella). I muscoli devono essere protetti dalla luce da questo passo in avanti per evitare di fotometabolismo di Alexa Fluor 647-fluorescenza.
3. Lavare i muscoli in PBS 1X 3 volte, 10 'ciascuno.
4. Eliminare ogni residuo di tessuto connettivo in PBS 1X, tagliare i bordi laterali dei muscoli LAL e montata sul lato dorsale fino diapositive, con copertura in vetro-scivola e supporti di montaggio. Usa chiaro smalto per fissare scivolare in posizione.
5. Proteggere diapositive dalla luce e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.

5. Confocale di NMJs LAL

1. Immagini confocale ad alta risoluzione sono ottenuti con un obiettivo di Piano olio Leica Apo 63x (1.4NA) su un microscopio confocale Leica TCS 4D.
2. Fluoresceina e Alexa 647 segnali sono stati acquisiti simultaneamente con linee laser 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) e 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), rispettivamente. In sequenza, il segnale viene poi scansionato Rodamina con la linea di laser a 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Sezioni ottiche sono stati raccolti a intervalli di 0,3 micron, e il numero di immagini nel piano z varia da 60-80 persone. Il foro stenopeico è regolato a 1 Airy (107,97 um). L'immagine in formato 1024 x 1024 (X, Y), con un fattore di zoom pari a 1, a velocità 400Hz risultati in un formato immagine di micron 234,32 x 234,32 micron e le dimensioni in pixel di 229,05 x 229,05 nm nm.
3. Leica TCS-NT software di acquisizione viene quindi utilizzato per ricostruire z-series immagini in proiezioni di massima intensità.
4. Immagini Multipanel sono corretti per luminosità e il contrasto utilizzando Adobe Photoshop.
5. Per un muscolo tipico LAL, si dovrebbe essere in grado di analizzare circa 75-100 NMJs en face. Stabilità Synaptic è determinato da caratteristiche come l'allineamento spaziale di pre-, peri-e post-sinaptici elementi (ad esempio, nervose, le cellule di Schwann e muscolare), e misure di superficie sinaptica (cioè, la dimensione sinapsi).

Rappresentante dei risultati:

Al NMJ mammifero adulto, un singolo assone motore elabora rami sottili che forma altamente differenziato pergolati di una terminazione nervosa (Fig. 2, verde) su una singola fibra muscolare, proprio apposto su cluster postsinaptici del AChR nicotinico (Fig. 2; Rosso) . Perisynaptically, terminale di cellule di Schwann strettamente coprire tutti i rami terminali nervosi presinaptici (Fig. 2; blu). L'integrità strutturale e funzionale di questa organizzazione tripartita è gravemente perturbato con l'applicazione quotidiana di sottotipi specifici inibitori mAChR. Nell'esempio qui presentato (Fig. 3), 4-umido, un antagonista mAChR con alta affinità per M1, M3, M4 e M5 sottotipi mAChR, evoca l'eliminazione selettiva delle terminazioni nervose da NMJs numerosi su tutta la superficie del muscolo (Fig. 3B, C). Inoltre, le cellule di Schwann terminali sono anormalmente quiescenti ⁸ come evidenziato dal brillante etichettatura S100 senza estensione del processo (Fig. 3B ", 3C"). Postsynaptically, fibre muscolari sono normali e non c'è perdita di nAChR (Fig. 3B ', 3C').

Figura 1. Posizione anatomica e l'organizzazione del muscolo LAL. Posizione rostrale (rLAL), caudale (CLAL), e il nervo LAL (LALn) e bande placca corrispondenti sono mostrati (A, riquadro). La posizione e l'orientamento dell'ago rispetto al muscolo LAL viene mostrato per la procedura di iniezione (B). Punti di incisione sono indicati per la procedura di dissezione (C).

Figura 2. Organizzazione tripartita del NMJ. Ad alto ingrandimento viste confocale di un NMJ mouse. Un singolo assone elabora rami terminali fine (A), ben coperto da cellule di Schwann terminali e dei loro processi (A ', punto di asterischi per gli enti di cellule di Schwann). Postsynaptically in una fibra muscolare, un gruppo di AChR nicotinico è proprio apposto ai rami del nervo terminaliNalles e terminale di cellule di Schwann.

Figura 3. LAL muscoli trattati con 4-umido, un antagonista mAChR. Viste confocale a basso e ad alto ingrandimento dei muscoli LAL trattati con veicolo o 4-UMIDO. In contrasto con il veicolo trattati muscolare (A-A NMJs'''), numerosi nel 4-DAMP trattati con mancanza terminali nervosi dei muscoli (B-B''', C-C'''). Un'area inscatolato nella figura 2B è ingrandita Figura 2C.

Discussione

Il metodo qui presentato permette di indagare ruoli precedentemente non riconosciuti della segnalazione specifica per sottotipo dei recettori mAChR nella stabilità e nel mantenimento delle giunzioni neuromuscolari (NMJ) nei mammiferi. Questo metodo sarà inoltre utile per testare gli effetti di fattori neurotrofici e di agenti farmacologici. Ad esempio, il nostro laboratorio ha scoperto che il fattore neurotrofico della corona ciliare (CNTF) induce la formazione di sprouting pressoché da tutti i terminali nervosi del musc...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ketamina	Hospira	NDC0409-2051-05	Dose: 120mg/kg
xylazina	Lloyd Laboratori	LA33806	Dose: 8mg/kg
atropina	Sigma-Aldrich	A0132	(Purezza> 98%); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg
atropina	Voigt Global Distribution	AT105	Di grado farmaceutico
Methoctramine	Sigma-Aldrich	M105	Dosi: 100 - 400M
4-UMIDO	Sigma-Aldrich	D142	Dose: 2,5 mg
AFDX-116	Bioscience Tocris	1105	250M
AFDX-384	Bioscience Tocris	1345	50M - 500M
MT 7	Peptidi internazionale	PMT-4340-s	0,1 M - 1M
Soluzione salina tamponata con fosfato 1X, pH 7,4	Invitrogen	10010049
Paraformaldeide	Pescatore	T353-500	Prova del 10% prima soluzione sciogliendo 10g/100mL deionizzata acqua distillata; fare 4% con PBS 1X, regolare il pH a 7,4
Sodio pentobarbitol	Virbac Animal Health	NDC-051311-050-01	Dose: 390mg/kg
Sylgard	Dow Corning	Part # 184	Seguire le istruzioni fornite con il kit, è possibile utilizzare più piatto cultura dimensioni (30mm, 60mm, 100 mm) a seconda delle esigenze
0,1 M glicina	Sigma-Aldrich	G-7126	Aggiungi 0.185g a 25mL del 2% BSA / PBS
2% di albumina sierica bovina (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Sciogliere 2 g in 100 ml di BSA PBS 1X
X100 Triton 0,2% nel 2% BSA / PBS (tampone di bloccaggio)	Sigma-Aldrich	T9284-100 ml	Sciogliere 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS
α-bungarotossina	Invitrogen	T1175	L'uso a una concentrazione di 1:200
SMI-312	Sternberger monoclonali	SMI312	L'uso a una concentrazione di 1:1000
SV2	Developmental Studies Ibridoma Banca	SV2-supernatante	L'uso alla concentrazione di 1:10
S100	Dako	Z0311	L'uso a una concentrazione di 1:400
FITC-capra anti-topo IgG1	Roche	03117731001	L'uso a una concentrazione di 1:200, ma se lo sfondo è elevata, provare 1:400
Alexa Fluor 647-capra coniugato anti-coniglio	Invitrogen	A21244	L'uso a una concentrazione di 1:200
Vectashield fluorescenti montaggio di mezzi	Vector laboratori	H-1000	Questo non è un hard-set di supporti, è necessario assicurare la polizza di copertura con smalto trasparente.
Forbici Primavera piccoli	Strumenti Scienza multa	15002-08
Dissezione forcipe	Strumenti Scienza multa	11295-51