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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Realizzare cuffie con due elettrodi bipolari (Figura 1)
- Tagliare 3,5 cm di filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene.
- Spelare circa 1 mm di rivestimento isolante dal filo su entrambe le estremità. Non spellare troppo filo.
- Metti due perni su un supporto per morsa con la parte inferiore del perno che ha una fessura più lunga rivolta verso il basso.
- Applicare il flusso sulle estremità spellate del filo e sulla parte superiore dei perni.
- Stagnare la parte spela del filo con una saldatura appena sufficiente per rivestirla.
- Aggiungere una quantità minima di saldatura alla parte superiore del pin senza traboccare sui lati.
- Posizionare un'estremità delle estremità spellate del filo nel pin il più in profondità possibile mentre la saldatura è fusa.
nota: C'è un foro laterale da cui il filo può uscire: non lasciare che il filo fuoriesca dal perno. Tutto il filo spellato deve rimanere all'interno del perno.
- Ripetere i passaggi 1.6-1.7 per il secondo pin, ora con le altre estremità spellate del filo.
- Lasciare riposare i perni per 30 secondi per indurirli, rimuoverli dal supporto della morsa, quindi tirarli per assicurarsi che il collegamento tra il filo e i perni sia forte e tenga.
- Sciacquare gli spilli in acqua fredda e poi asciugarli.
- Verificare la conduttanza tra il pin 1 e il pin 2 utilizzando un ohmmetro.
- Unire i perni alle estremità del filo, tenerli paralleli e vicini. Fissare un emostatico al centro del filo. Quindi, ruotare l'emostato, in modo che il filo si attorcigli su se stesso abbastanza stretto. Rimuovere l'emostato.
- Fissare una pinza sul filo intrecciato 2 mm sotto i perni e piegare il filo a 90°.
- Spingi di nuovo lo stesso filo di 90° sopra la pinza creando un'altra curva a 1 mm dal primo.
- Tagliare il filo intrecciato con un angolo di 45° sotto la curva a 3,5 mm con piccole forbici affilate.
- Preparare due di questi elettrodi bipolari (a doppio pin attorcigliato) per ciascuna cuffia (opzionale, il secondo è di riserva in caso di problemi elettrici con il primo).
- Preparare un singolo elettrodo di riferimento tagliando in due un filo con perni saldati su entrambe le estremità (passaggi 1.1-1.17, Figura 1A).
- Tagliare il filo a 7 mm.
- Piegare l'estremità 1 mm sotto la punta.
- Quindi, coprire la punta piegata di 1 mm del filo con una pinza e ruotare il filo stretto attorno alla pinza per creare un piccolo anello (1 mm di diametro).
- Piegare l'anello perpendicolarmente alla parte diritta del filo per fare in modo che la punta del filo punti di nuovo verso l'esterno.
- Assemblare i due elettrodi bipolari e l'elettrodo di riferimento singolo nel piedistallo a sei pin in modo che gli elettrodi bipolari siano affiancati con una distanza di 6 mm tra loro e che l'elettrodo di riferimento sia posizionato nel foro esterno centrale (Figura 1B).
nota: Un metodo alternativo consiste nell'impiantare gli elettrodi, cementarli in posizione e quindi inserire i loro perni nel piedistallo.
2. Impianto di elettrodi stereotassici
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il gruppo elettrodo a sei pin mediante sterilizzazione in autoclave prima dell'intervento. Durante l'intervento deve essere mantenuto un campo chirurgico sterile e devono essere utilizzati guanti chirurgici sterili. Si consiglia di utilizzare teli sterili (ad es. Press n' Seal) per coprire l'animale, ad eccezione dell'area chirurgica.
- Utilizzare topi VGAT-Cre di 8 settimane (che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del gene del trasportatore vescicolare GABA [VGAT], di pari età, sia maschio che femmina) per interventi chirurgici 4 settimane dopo lo svezzamento. Registrare il peso dell'animale prima dell'intervento chirurgico per consentire la misurazione della perdita di peso post-chirurgica.
- Usa un vaporizzatore certificato di isoflurano o un sistema di anestesia a basso flusso dotato di una pompa a siringa di precisione, un vaporizzatore digitale integrato e un cuscinetto termico di feedback.
nota: I sistemi a basso flusso sono in grado di erogare l'anestesia a basse velocità di flusso proporzionate alle dimensioni dell'animale in una camera di induzione o attraverso un cono nasale sul telaio stereotassico (70 ml/min, la concentrazione di isoflurano nell'aria è del 4% per l'induzione e del 2% per la chirurgia). L'uso di meno anestesia non solo avvantaggia l'animale durante gli interventi chirurgici, ma riduce anche il rischio di esposizione del personale di laboratorio all'isoflurano.
- Posizionare l'animale anestetizzato su un cuscinetto riscaldato riscaldato a 37 °C per mantenerlo caldo durante l'intervento chirurgico. Se si utilizza un sistema di temperatura a feedback controllato, inserire la sonda di temperatura leggermente lubrificata nel retto dell'animale per il monitoraggio della temperatura durante l'intervento chirurgico.
- Monta l'animale sulla montatura stereotassica posizionando delicatamente le barre auricolari nelle orecchie e i denti superiori anteriori nella barra incisiva. Posizionare il cono nasale sopra il naso per una corretta erogazione dell'anestesia. Assicurarsi che la testa sia livellata e centrata e che non possa essere spostata quando viene leggermente sondata.
- Iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di normosol per l'idratazione.
- Applicare lubrificante oculare per prevenire l'essiccazione corneale.
- Monitorare la profondità dell'anestesia in base all'assenza del riflesso di ritiro dopo aver pizzicato un dito del piede dell'arto posteriore, quindi ridurre l'isoflurano all'1,5%-2,0% durante l'intervento chirurgico.
- Rimuovere i peli in corrispondenza e intorno all'area chirurgica strappando o utilizzando un tagliacapelli (rasatura) o una crema depilatoria e disinfettare la pelle con tre cicli di applicazione alternata di iodio ed etanolo, terminando con lo iodio. Si raccomanda di rimuovere i peli dal sito chirurgico solo se ci sono mezzi per mantenere l'anestesia in quella posizione. Se necessario, utilizzare applicatori con punta di cotone imbevuti di alcol per rimuovere i peli dall'area circostante la testa. Iniettare 0,05 ml di analgesico locale bupivacaina (0,25%) per via sottocutanea.
- Fai un'incisione sul cranio usando un bisturi, quindi ritaglia una parte della pelle con forbici chirurgiche affilate, esponendo il cranio. Spingendo la pelle da parte, usando un batuffolo di cotone, pulire il cranio da tutti i muscoli e i tessuti sottostanti che ostruiscono la vista><.
nota: Per fermare l'emorragia accidentale, applicare pressione sul sito di sanguinamento con un batuffolo di cotone sterile fino all'arresto.
- Pulisci il cranio con perossido di idrogeno usando tamponi di cotone sterili per rendere visibili le suture del cranio e sia la bregma che la lambda.
- Asciugare accuratamente il cranio, quindi applicare una goccia di adesivo dentale automordenzante utilizzando il suo applicatore. Spazzolalo nel cranio, attendi 60 s e polimerizza con una luce UV dentale per 40 s. Una superficie lucida indica che l'adesivo è stato efficacemente reticolato con il cranio.
nota: Questo passaggio è fondamentale per un fissaggio sicuro dell'auricolare.
- Utilizzare una punta da trapano da 0.031" (0.79 mm) per praticare due fori di fresatura bilateralmente per l'impianto di elettrodi di profondità ippocampali (circa 5,000 giri/min). Praticare un foro di fresatura in più per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro il lambda.
NOTA: Durante la perforazione, fare attenzione ad abbassare lentamente il trapano ed evitare di perforare il cervello.
- Le coordinate per gli elettrodi sono le seguenti (da bregma in mm): elettrodi ippocampali a 3 mm di profondità, 3 mm lateralmente e 3 mm; ed elettrodo di riferimento cerebellare a 6 mm di profondità, 0 mm lateralmente e 0 mm di profondità (subdurale).
- Per aumentare la precisione, utilizzare un trapano montato stereotassicamente, azzerare l'asse X/Y del manipolatore stereotassico quando si tocca bregma: questo è il punto di riferimento per le coordinate.
- Assemblare una cuffia inserendo tutti gli elettrodi nel piedistallo a sei pin, assicurandosi che i perni siano spinti fino in fondo nel piedistallo. Montare il piedistallo nel portaelettrodo su un telaio stereotassico (Figura 1B).
- Allineare gli elettrodi sopra i fori di fresatura corrispondenti. Impiantare stereotassicamente elettrodi bipolari in acciaio inossidabile attorcigliati nell'ippocampo destro e sinistro e l'elettrodo di riferimento nel cervelletto abbassando lentamente la cuffia e guidando gli elettrodi nei fori di fresatura.
- Quando l'elettrodo di torsione dell'ippocampo si trova proprio sopra il foro, azzerare l'asse Z e abbassarlo lentamente fino a -3,0 mm.
- Copri la superficie del cranio e gli elettrodi con cemento dentale e riempi lo spazio tra la superficie del cranio e la parte inferiore del piedistallo. I bordi della pelle saranno adiacenti al cemento dentale in modo tale che nessun tessuto sottostante rimanga esposto. Attendere che il cemento si asciughi e si indurisca. Quindi staccare il portaelettrodo dal braccio stereotassico e rimuovere il supporto dal piedistallo.
- Iniettare 0,1 ml di ketoprofene (1 mg/mL, per via sottocutanea [SC]) per l'analgesia e una seconda dose di 0,5 ml di normosol (SC) per l'idratazione e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
- Posizionare un tampone isotermico preriscaldato a 37 °C all'interno di una gabbia vivarium vuota coperta da un tovagliolo di carta. Una volta che è completamente sveglio, metti l'animale in una gabbia pulita con lettiera e cibo morbido e rimettilo nel vivaio. Da questo momento in poi, gli animali vengono alloggiati singolarmente per evitare che si mastichino a vicenda le cuffie. Le tramogge delle barre metalliche non vengono utilizzate per evitare che le cuffie si blocchino, ma le bottiglie d'acqua sono legate alla parte inferiore della parte superiore della gabbia e il cibo è presente nella lettiera.
- Somministrare all'animale del cibo morbido per 72 ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare la perdita di peso e il punteggio della condizione corporea. Agli animali disidratati possono essere somministrati 0,5 ml di normosol per via sottocutanea se disidratati (perdita di peso, aumento del turgore cutaneo, occhi infossati). Il ketoprofene può essere somministrato per via sottocutanea una volta al giorno per altri 2 giorni dopo l'intervento chirurgico (seguire il regime di analgesia secondo le linee guida del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali [IACUC]). Lasciare che gli animali si riprendano completamente nelle loro gabbie per 4-7 giorni prima di essere trasferiti al sistema di registrazione per elettroencefalografia (EEG).
