Un In vivo Immagini di protocollo per monitor principale assoni sensoriali seguenti schiacciare spinali è descritto. Le procedure di utilizzo ad ampio campo di microscopia a fluorescenza e topi transgenici Thy1-YFP, e permettere l'imaging ripetuta di rigenerazione degli assoni più di 4 cm nel SNP e le interazioni degli assoni con l'interfaccia del sistema nervoso centrale.
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Articolo metodologico
Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli assoni sensoriali primarie ferito da lesioni radice spinale non riescono a rigenerarsi nel midollo spinale, con conseguente dolore cronico e permanente perdita di sensibilità. Rigenerazione della radice dorsale (DR) assoni nel midollo spinale è impedito l'ingresso in zona dorsale principale (DREZ), l'interfaccia tra il SNC e SNP. La nostra comprensione degli eventi molecolari e cellulari che impediscono la rigenerazione a DREZ è incompleta, in parte perché i cambiamenti complessi associati a danno del nervo sono stati dedotti dalle analisi post-mortem. Dinamica dei processi cellulari, come la rigenerazione degli assoni, sono i migliori studiati con tecniche che catturano eventi in tempo reale con le osservazioni più di ogni animale vivente. La nostra capacità di monitorare i neuroni in serie in vivo, è aumentato drammaticamente a causa di innovazioni rivoluzionarie nel campo dell'ottica e mouse transgenici. Diverse linee di Thy1-GFP topi transgenici, nei quali sottopopolazioni di neuroni sono geneticamente etichettati in distinti colori fluorescenti, consentono singoli neuroni di essere ripreso in vivo 1. Questi topi sono stati ampiamente utilizzati per imaging in vivo dei muscoli e del cervello 2-4 5-7, e hanno fornito indicazioni romanzo in meccanismi fisiologici che le analisi statiche non poteva essere risolto. Studi di imaging di neuroni nel midollo spinale di vita hanno cominciato solo di recente. Lichtman ei suoi colleghi hanno dimostrato la loro fattibilità per il monitoraggio feriti colonna dorsale (DC) assoni con grande campo microscopia 8,9. Multi-fotone in imaging in vivo di profondamente posizionati assoni DC, microglia e dei vasi sanguigni è stato anche compiuto 10. Nel corso degli ultimi anni, siamo stati i primi ad applicare imaging in vivo di monitorare la rigenerazione degli assoni DR utilizzando la microscopia a largo campo e la linea H del Thy1-YFP topi. Questi studi ci hanno portato ad una nuova ipotesi sul perché gli assoni DR viene impedito di rigenerazione nel midollo spinale 11.
In linea H del Thy1-YFP topi, distinto YFP assoni + sono posizionati superficialmente, che consente assoni diversi da monitorare contemporaneamente. Abbiamo imparato che gli assoni DR arrivare a DREZ sono meglio ripreso in lombare che nel midollo spinale cervicale. Nella presente relazione si descrivono diverse strategie che abbiamo trovato utile per assicurare il successo di imaging a lungo termine e ripetuti di rigenerare gli assoni DR. Tra questi metodi che eliminano l'intubazione ripetute e interruzione delle vie respiratorie, ridurre al minimo la chirurgia associata a stress e la formazione di cicatrici, e di acquisire immagini stabili ad alta risoluzione senza fototossicità.
Protocollo
1. Microscopio impostare e preparazione di imaging
- Il nostro set è composto da immagini di uno stereomicroscopio Leica MZ16 fluorescente con un otturatore veloce e una camera CCD raffreddata controllato dal software Metamorph.
- Preparare una piastra elettrica termostato e regolare uscita a 32,5 ° C per mantenere la temperatura del corpo dell'animale durante e dopo l'intervento.
- Caldo Ringer sterile la soluzione o artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) a 32,5 ° C in anticipo per l'irrigazione del midollo spinale durante l'intervento.
- Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di xylazina (8 mg / kg) e ketamina ....
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Discussione
Imaging DR rigenerazione direttamente in topi vivi è particolarmente impegnativa perché richiede una notevole laminectomia dorsale di monitorare la crescita degli assoni su una vasta area seguito da più interventi chirurgici invasivi e anestesia nelle sessioni successive di imaging. Diverse strategie aiutato a superare queste sfide. In primo luogo, l'imaging di successo richiede la riduzione della mortalità del mouse (circa il 25%), riducendo al minimo la durata dell'anestesia e sanguinamento, e da una meticolos.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Alan Tessler per i commenti e aiuto editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NS062320.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Linea H Thy1-YFP (2-4 mesi di età, entrambi i sessi) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazina (iniezione AnaSed, soluzione sterile) | Laboratori Lloyd, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg / kg |
| La ketamina (iniezione ketamina cloridrato, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, Illinois) | 2051 | 120 mg / kg |
| Buprenorfina (iniettabile Buprenex) (0,05 mg / kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) | 7571 | |
| Piccoli animali Tagliacapelli | Oster Professionale, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Depilazione lozione | Church & Dwight Co. (Princeton, NJ) | NAIR con Baby Olio | |
| Garza spugne | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Tamponi di cotone con punta | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| Siringhe da 1 ml | Becton, Dickson e Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Sottocutanea (Sub-Q) aghi, 26ga. | Becton, Dickson e Società (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Forbici e pinze a molla | Strumenti Scienza fine, (Foster City, CA) | ||
| Rongeurs curve da 2,5 mm | Strumenti Scienza fine, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Iniezione Ringer lattato USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Soluzione salina sterile | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Sottile membrana matrice sintetica (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Dura artificiale | Gore Impedire MVP Sostituto Dura, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 punti di sutura di seta | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Ferita clip | Perfetto - Ets Bruneau, (Burnea, Francia) | A75 | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germania) | MZ16 | |
| CCD | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Controllore di temperatura | Mondo Strumenti di precisione (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | I dispositivi molecolari, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Riferimenti
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
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Ristampe e permessi
