Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione e coltura della fetta organotipica dell'ippocampo
NOTA: Questo protocollo consente la produzione di fette ippocampali organotipiche. Idealmente, non più di tre animali dovrebbero essere soppressi e sezionati in una sessione per garantire che ogni passaggio venga eseguito rapidamente e per evitare di compromettere la qualità delle fette. Utilizzare una tecnica asettica in tutto.
- Assicurarsi che vengano eseguiti i seguenti passaggi prima di iniziare il protocollo di dissezione.
- Preparare e filtrare, sterilizzare tutte le soluzioni in anticipo utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Mantenere le soluzioni a 4 °C durante la conservazione e durante la dissezione cerebrale e la preparazione della fetta di ippocampo, tenendo sempre i contenitori di conservazione e le piastre di Petri su un dissipatore di calore metallico appoggiato su ghiaccio bagnato.
- Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti metallici, gli anelli e i fazzoletti di carta.
- Assicurarsi che tutti gli strumenti e i materiali da utilizzare per ogni fase del protocollo siano pronti all'uso, disposti in anticipo e spruzzati con etanolo al 70%. Quindi, lasciateli raffreddare e asciugare.
- Sopprimere un cucciolo di topo C57BL/6N di 5-7 giorni mediante lussazione cervicale e pulire brevemente l'intera superficie della pelle con un fazzoletto di carta sterile imbevuto di etanolo al 70%. Asciuga la pelle e decapita il cucciolo usando le forbici alla maionese.
- Taglia la pelle del cuoio capelluto con le forbici dell'iride lungo la linea mediana della testa, iniziando dalla regione occipitale e terminando vicino al muso, e ritraila lateralmente.
- Inserire la punta delle forbici di Vannas nel forame magno e praticare due piccoli tagli laterali sull'osso lungo i seni trasversali, quindi tagliare il cranio lungo la linea mediana fino al bulbo olfattivo e fare due piccoli tagli perpendicolarmente alla linea mediana in questa regione.
- Utilizzando una pinza curva a punta fine, ritrarre i lembi di osso lateralmente lontano dalla linea mediana. Rimuovere con cautela il cervello con una piccola spatola e trasferirlo in una piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico da 90 mm contenente un "mezzo di dissezione"
nota: Il mezzo di dissezione è la soluzione salina bilanciata di Gey (5 mg/mL di D-glucosio, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 10.000 unità/mL di penicillina, 10 mg/mL di streptomicina e 25 μg/mL di amfotericina B).
- Rimuovere il cervelletto e separare gli emisferi cerebrali lungo la linea mediana utilizzando una lama di rasoio. Utilizzare una spatola per trasferire gli emisferi cerebrali in una nuova piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico da 90 mm riempita con terreno di dissezione fresco e ghiacciato. Se si desidera utilizzare più di un animale in una sessione, ripetere i passaggi da 1.2 a 1.6.
- Sotto uno stereomicroscopio, taglia il bulbo olfattivo e la punta della corteccia frontale con una lama di rasoio e separa la corteccia cerebrale dal resto del tessuto cerebrale usando una pinza a punta fine. Questo passaggio lascia l'ippocampo esposto sulla superficie mediale del tessuto corticale. Da questo passaggio in poi, utilizzare una cappa di coltura tissutale a flusso laminare (sterilizzata a raggi ultravioletti e pulita con una soluzione di etanolo al 70%).
- Applicare un mezzo di dissezione ghiacciato su un disco da taglio piatto di plastica e, utilizzando una spatola, posizionare il tessuto cerebrale sul disco in modo tale che la superficie mediale della corteccia sia rivolta verso l'alto e l'asse dell'ippocampo sia perpendicolare all'asse della lama da taglio.
- Rimuovere il più possibile il mezzo di dissezione dal disco da tritare utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
- Tagliare il cervello in fette di 400 μm utilizzando un tritatutto a una velocità e una forza di taglio del 50%.
nota: Questo passaggio deve essere completato il più rapidamente possibile, poiché il tessuto cerebrale non è immerso nel mezzo di dissezione.
- Sostituire il mezzo di dissezione nella piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico con il mezzo fresco ghiacciato.
- Una volta terminato il trinciafazzo, immergere con cura il tessuto cerebrale in un mezzo di dissezione fresco e trasferire nuovamente il tessuto tagliato nella piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico da 90 mm utilizzando un bisturi a lama dritta.
- Sotto uno stereomicroscopio, separare con cura le fette corticali usando una pinza a punta fine. Per ogni fetta, ispezionare l'ippocampo per verificare la presenza di morfologia e potenziali danni ai tessuti derivanti dalla dissezione o dall'affettatura.
- Separare l'ippocampo dalla corteccia entorinale e dalla fimbria utilizzando una pinza a punta fine e piccole forbici Vannas. In genere, vengono generate da 6 a 8 fette di ippocampo per emisfero.
- Trasferire fino a 6 fette di ippocampo su un inserto di coltura tissutale utilizzando una pipetta Pasteur tagliata e posizionarla all'interno di una piastra Petri da 35 mm. Assicurarsi che le fette siano distanziate di alcuni millimetri l'una dall'altra (in questo modo ogni fetta può essere ripresa individualmente).
- Aggiungere immediatamente un "terreno di coltura" ghiacciato sul fondo di ciascuna piastra di Petri, sotto l'inserto di coltura tissutale, appena sotto la parte superiore del bordo dell'inserto di coltura tissutale.
nota: Il terreno di crescita contiene il 50% di terreno essenziale minimo Eagle, il 25% di soluzione salina bilanciata di Hanks, il 25% di siero di cavallo, 5 mg/mL di D-glucosio, 2 mmol/L di L-glutammina, l'1% di soluzione antibiotica-antimicotica e 10 mmol/L di HEPES(acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico), titolato a pH 7,2 con idrossido di sodio.
- Cambiare il terreno di coltura il giorno dopo la dissezione e successivamente ogni 2 o 3 giorni (utilizzare il terreno di crescita a 37 °C). Assicurarsi che il terreno di coltura sia aggiunto a sufficienza, ma non così tanto da traboccare dalla membrana dell'inserto di coltura tissutale, il che potrebbe compromettere la vitalità delle fette di tessuto.
- Prima di essere utilizzate negli esperimenti, conservare le fette di tessuto in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di anidride carbonica nell'aria per 12-14 giorni.
2. Preparazione delle fette organotipiche dell'ippocampo per il protocollo sperimentale Blast TBI
NOTA: Le fasi di questa sezione, ad eccezione dell'imaging, si svolgono in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare.
- Inserire gli anelli in acciaio inossidabile su misura in una piastra a 6 pozzetti (uno per pozzetto).
NOTE: Gli anelli hanno un bordo con una tacca (che dovrebbe essere posizionata a ore 12) e si adattano perfettamente all'interno dei pozzetti, mentre gli inserti di coltura tissutale si inseriscono facilmente in questo bordo. Assicurarsi che gli anelli siano lavati con un disinfettante battericida, risciacquati accuratamente con acqua purificata, sterilizzati in autoclave e lasciati raffreddare in anticipo.
- Riempire il pozzetto della piastra a 6 pozzetti con "terreno sperimentale" preriscaldato (37 °C) privo di siero con ioduro di propidio.
nota: Il terreno sperimentale con ioduro di propidio è il 75% di terreno essenziale minimo Eagle, il 25% di soluzione salina bilanciata di Hanks, 5 mg/mL di D-glucosio, 2 mmol/L di L-glutammina, l'1% di soluzione antibiotica-antimicotica, 10 mmol/L di HEPES e 4,5 μmol/L di ioduro di propidio, pH titolato a 7,2 con idrossido di sodio.
- Assicurarsi che il livello del mezzo non superi la tacca dell'anello. Trasferire la piastra a 6 pozzetti con gli anelli nell'incubatore per 1 ora per assicurarsi che il terreno sia a 37 °C immediatamente prima del trasferimento degli inserti per colture tissutali.
- Trasferire gli inserti di coltura tissutale con le fette organotipiche dalle piastre di Petri da 35 mm nella piastra a 6 pozzetti con gli anelli e il terreno sperimentale con pinze.
- Fare un punto sul bordo dell'inserto a ore 3 con un pennarello indelebile.
nota: Gli inserti saranno rimossi dalla piastra a 6 pozzetti durante l'esperimento. Questo passaggio facilita il ritorno dell'inserto nella sua posizione originale dopo l'esposizione all'onda d'urto e tiene facilmente traccia di ogni fetta durante tutto il protocollo.
- Etichettare ogni piastra a 6 pozzetti con un nome e una data univoci e creare una mappa dei pozzetti di ogni piastra, nominando ogni pozzetto (ad esempio, A, B, C, ecc.) e ogni fetta in ogni pozzetto (ad esempio, 1, 2, 3, ecc.), in modo che ogni fetta abbia un identificatore univoco (ad esempio, A1, A2, A3, ecc.).
- Trasferire la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore per 1 ora immediatamente prima dell'imaging per assicurarsi che le fette siano a 37 °C.
nota: Evitare la traboccamento del terreno o le bolle d'aria sotto la membrana dell'inserto di coltura tissutale, che potrebbero compromettere la vitalità delle fette.
- 1 ora dopo il trasferimento al mezzo sperimentale, visualizzare ogni fetta singolarmente utilizzando un microscopio a fluorescenza (obiettivo 2X, NA 0,06) dotato di un filtro di eccitazione (BP 535/50 nm) e di emissione (LP 610 nm) appropriato per valutare lo stato della fetta prima che venga eseguito il protocollo di lesione.
Note: Le fette che presentano aree di colorazione rossa densa in questa fase dovrebbero essere considerate come se presentassero una vitalità compromessa e dovrebbero essere escluse da ulteriori analisi (queste rappresentano tipicamente meno del 10% del numero totale di fette generate). Assicurarsi che l'imaging venga eseguito in sequenza e il più rapidamente possibile per ridurre al minimo il tempo in cui le fette rimangono fuori dall'incubatore (in genere 6 pozzetti dovrebbero richiedere poco meno di 30 minuti per l'acquisizione).
- Tenere sempre il coperchio della piastra a 6 pozzetti. Potrebbe formarsi della condensa all'interno del coperchio. In tal caso, utilizzare brevemente un asciugacapelli a bassa temperatura.
- Assicurarsi che tutte le condizioni di imaging siano identiche nei giorni diversi e tra gli esperimenti.
nota: Lo scopo dell'imaging è quantificare la fluorescenza tissutale; Pertanto, questo passaggio è importante per garantire la riproducibilità dei risultati e consentire il confronto dei dati.
3. Immersione e trasporto degli inserti di coltura tissutale con le fette organotipiche dell'ippocampo
- Immediatamente dopo l'imaging, in una cappa a flusso laminare, una coltura tissutale viene estratta dalla piastra a 6 pozzetti utilizzando una pinza.
- Trasferire con cautela l'inserto in una sacca sterile di polietilene (3" x 5") pre-riempita con 20 mL di terreno sperimentale caldo (37 °C) appena bollato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.
nota: Assicurarsi che il terreno sperimentale arricchito con ossigeno e anidride carbonica sia stato fatto bollire per almeno 40 minuti con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica utilizzando un gorgogliatore di vetro sinterizzato all'interno di un flacone Dreschel e trasferito nelle sacche sterili di polietilene all'interno di una cappa di coltura tissutale a flusso laminare utilizzando una siringa da 20 ml con un filtro batterico e una provetta di riempimento sterile (127 mm) collegata. Sigillare immediatamente i sacchetti e trasferirli in un'incubatrice a 37 °C per almeno 1 ora prima del trasferimento dell'inserto di coltura tissutale.
- Assicurarsi che ogni sacca sterile sia etichettata correttamente (con la targhetta e l'identificazione del pozzetto). Ripetere questo passaggio per ogni foglietto illustrativo di coltura tissutale. Escludere con cura le bolle d'aria dopo aver sigillato le buste sterili (farlo in modo sicuro ruotando la parte superiore delle buste e applicando una fascetta di plastica).
- Rimettere le sacche sterili con gli inserti per colture tissutali e le piastre a 6 pozzetti con terreno sperimentale nell'incubatore a 37 °C.
- Dopo 1 ora, imballare accuratamente le sacche sterili con gli inserti di coltura tissutale in scatole di plastica all'interno di una scatola termoregolata riempita con acqua deionizzata a 37 °C per mantenere le fette organotipiche alla temperatura fisiologica durante tutto il protocollo di esposizione alle onde d'urto.
4. Preparazione del tubo d'urto e dell'esposizione alle onde d'urto organotipiche della fetta ippocampale
- Indossare stivali protettivi con punta in acciaio, camice da laboratorio e guanti durante la preparazione del tubo d'urto e l'esposizione dell'onda d'urto.
- Avvitare il telaio del supporto della sacca sterile alla flangia distale del tubo dell'ammortizzatore, assicurandosi che il foro centrale sia allineato con l'uscita del tubo dell'ammortizzatore (utilizzando un'asta di chiusura).
- Montare radialmente due trasduttori di pressione: il sensore 1 nella parte centrale della sezione condotta e il sensore 2 nella flangia distale del tubo d'urto (Figura 1A). Collegare i trasduttori di pressione a un oscilloscopio tramite un'unità di alimentazione con sorgente di corrente.
- Assicurarsi che tutte le valvole di rilascio del tubo dell'ammortizzatore e i controlli di flusso siano chiusi.
- Aprire la linea esterna dell'aria compressa e caricare l'elettrovalvola a 2,5 bar.
- Aprire la valvola di sicurezza della bombola dell'aria compressa e aprire lentamente il regolatore di pressione per aumentare la pressione a circa 5 bar.
NOTA: La pressione impostata per questo regolatore deve essere leggermente superiore alla pressione massima di scoppio della membrana.
- Preparare i diaframmi tagliando fogli di poliestere di 23 μm di spessore in quadrati di 10 x 10 cm2. Preparare le maniglie con del nastro adesivo per autoclave e attaccarle alla parte superiore e inferiore di ogni diaframma.
- Posizionare un diaframma (fessura singola della configurazione culatta doppia - diaframma singolo) o due diaframmi (entrambe le fessure della configurazione culatta doppia - doppia membrana) nella culatta (Figura 1B).
- Centrare le membrane e bloccarle utilizzando quattro bulloni e dadi M24, fissandole in sequenza in modo diagonalmente simmetrico e assicurandosi che le membrane siano prive di pieghe.
- Bloccare ciascuna sacca sterile singolarmente in posizione verticale sul telaio del supporto, assicurandosi che la superficie degli inserti di coltura tissutale con le fette ippocampali organotipiche sia rivolta verso l'uscita del tubo d'urto e che l'inserto di coltura tissutale sia centrato all'interno della sacca sterile (Figura 1C). Assicurarsi che la sacca sterile sia fissata saldamente tutt'intorno per garantire un'immobilizzazione salda e uniforme.
- Indossare cuffie antirumore e occhiali di sicurezza quando si preme il tubo dell'ammortizzatore. Accendere l'unità di alimentazione della sorgente di corrente e l'oscilloscopio per acquisire i dati dell'onda d'urto (velocità di acquisizione di 50 mega-campioni/s, lunghezza di registrazione 20 ms, 1 milione di punti) e chiudere l'elettrovalvola.
- Utilizzando la manopola di controllo del flusso sul pannello di controllo del tubo dell'ammortizzatore, pressurizzare lentamente la sezione del volume del driver del tubo dell'ammortizzatore per la configurazione a diaframma singolo o sia la sezione del volume del driver che la sezione della doppia culatta del tubo dell'ammortizzatore per la configurazione a doppio diaframma.
nota: Per la configurazione a membrana singola, la pressione di scoppio dipenderà solo dal materiale e dallo spessore della membrana e la membrana si romperà spontaneamente una volta raggiunta la pressione di scoppio del materiale. Per la configurazione a doppia membrana, la pressione di scoppio dipenderà anche dal differenziale di pressione del gas sia nel driver che nella doppia camera di culatta, e per lo scoppio delle membrane in modo controllato, la valvola di sicurezza a doppia culatta viene aperta manualmente una volta raggiunte le pressioni target.
- Non appena il diaframma si rompe (producendo un forte rumore), chiudere rapidamente il flusso d'aria compressa utilizzando la manopola di flusso e aprire l'elettrovalvola.
nota: Il volume totale della sezione driver può essere modificato mediante l'inserimento di segmenti di blanking, consentendo di ottenere una gamma più ampia di sovrapressione di picco e durate delle onde d'urto. La combinazione ideale di parametri dell'onda d'urto dovrebbe essere sufficiente a causare lesioni tissutali, ma non così elevata da causare l'inserimento della coltura tissutale o la distorsione o la rottura della sacca sterile.
- Esporre ogni sacca sterile con coltura tissutale, inserirla in un singolo tubo d'urto a onda e rimetterla immediatamente nella scatola termoregolata prima che una nuova sacca sterile venga estratta dalla scatola e bloccata sul telaio del supporto. Assicurarsi che le fasi 4.10-4.14 siano eseguite nel modo più fluido e rapido possibile (entro pochi minuti) per evitare che il mezzo sperimentale si raffreddi, poiché temperature inferiori a 37 °C possono interferire con lo sviluppo di lesioni.
- Una volta che tutti gli inserti di coltura tissutale sono stati esposti a un'onda d'urto (o protocollo fittizio), rimetterli nella piastra originale a 6 pozzetti e nel rispettivo pozzetto (all'interno di una cappa di coltura tissutale a flusso laminare) e rimetterli nell'incubatore.
- Conservare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore con il 5% di anidride carbonica nell'aria a 37 °C fino a ulteriori imaging.
- Includere controlli fittizi per ogni esperimento e l'esposizione alle onde d'urto slice.
nota: Le fette fittizie vengono trattate in modo identico alle fette esposte a un'onda d'urto (sigillate nelle sacche sterili con mezzo sperimentale, trasportate al laboratorio del tubo d'urto nella stessa scatola termoregolata e sospese sul telaio metallico per un periodo di tempo equivalente), ma il tubo d'urto non viene sparato.
