Stabilire un modello di malattia di Alzheimer nel cervello di zebrafish attraverso l'iniezione di peptidi amiloidi

Abstract

Bhattarai, P., et al. Modellazione della tossicità e della neurodegenerazione dell'amiloide-β42 nel cervello adulto di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video dimostra la procedura di iniezione di peptidi amiloidi monomerici nel proencefalo di zebrafish adulto per generare tossicità amiloide, imitando il danno neuronale osservato nella malattia di Alzheimer

Protocollo

1. Preparazione del peptide Aβ42

1. Sintetizzare peptidi (vedi Tabella 1) utilizzando la chimica standard 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronoioesafluorfosfato (HBTU) come reagente di accoppiamento su un sintetizzatore di peptidi automatizzato in fase solida. La scala della sintesi era di 100 μmol.
2. Caricare il sintetizzatore peptidico automatizzato con 500 mg di resina protetta da Fmoc come fase solida (capacità di carico di 0,2 mmol/g). Caricare gli amminoacidi protetti da Fmoc disciolti a una concentrazione di 0,5 M nel volume richiesto e come calcolato per il rispettivo sintetizzatore.
   nota: I calcoli sono effettuati per consentire l'accoppiamento di ciascun amminoacido protetto da Fmoc due volte con un eccesso di 5 volte di ciascun elemento costitutivo alla resina.
3. Sciogliere i reagenti necessari per la sintesi dei peptidi in dimetilformammide (DMF). Ad esempio, preparare l'attivatore, HBTU, a una concentrazione di 0,48 M, 45% v/v di N-metilmorfolina (NMM) (la base) e 5% v/v di anidride acetica (la miscela di tappatura) per tappare i gruppi amminici non reagiti.
4. Scindere tutti i peptidi dalla resina mescolando continuamente il supporto solido utilizzando un agitatore in una miscela di scissione appena preparata costituita da acido trifluoroacetico (TFA): triisopropilsilano (TIS): acqua: ditiotreitolo (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m/v) per 4 ore. Utilizzare 10 mL per la scala di sintesi di 100 μmol.
5. Far precipitare il prodotto scisso aggiungendo la miscela di scissione a 100 mL di etere etilico ghiacciato. Passare attraverso un'unità di filtrazione contenente un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) con una dimensione dei pori di 0,45 μm e lavare con 20 ml di etere etilico ghiacciato.
6. Raccogliere il peptide filtrato dalla carta da filtro e sciogliere 100 mg di peptide precipitato in 5 mL di acqua deionizzata distillata: acetonitrile a 1:1.
7. Purificazione mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) in fase inversa su un'HPLC semi-preparativa dotata di una colonna porosa di polistirene divinilbenzene con una dimensione delle microsfere di 10 μm.
   1. Preriscaldare la colonna e mantenerla a 50 °C utilizzando un dispositivo di riscaldamento della colonna. Raccogliere tutte le frazioni principali utilizzando un raccoglitore automatico di frazioni applicando un gradiente dal 5% al 100% di solvente B per 25 minuti a 4 mL/min.
      nota: Il solvente A è lo 0,1% di TFA in acqua e il solvente B è lo 0,1% di TFA nell'acetonitrile.
   2. Monitorare il cromatogramma a 220 nm, raccogliere i picchi appropriati e analizzare utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).
8. Confermare la purezza mediante cromatografia liquida analitica ad altissima pressione in fase inversa (UPLC) a 220 nm, monitorando con un rivelatore a raggi ultravioletti (UV) e facendo passare il campione attraverso una colonna analitica C18 (dimensione del microscotto 1,7 μm). Confermare il prodotto peptidico mediante spettrometria di massa.
   nota: L'UPLC è accoppiato a una spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e a un rivelatore a quadrupolo tandem.
9. Liofilizzare le frazioni corrette del peptide desiderato in un pallone a fondo tondo applicando un vuoto di 0,052 mbar su una polvere soffice. Accoppiare la pompa del vuoto a un'unità di congelamento mantenuta a -78 °C. Conservare a -80 °C a tempo indeterminato.
10. Utilizzare il peptide liofilizzato per preparare una soluzione madre di 1 mM in una miscela di acetonitrile, DMF e acqua di grado analitico a 1:1:1 per gli esperimenti. Questa soluzione può essere conservata per almeno 6 mesi, poiché i peptidi non si aggregano in essa.

2. Preparazione della miscela per iniezione

1. Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) per diluire i peptidi liofilizzati.
2. Sciogliere il peptide a una concentrazione finale di 20 μM in PBS. Prepara questa soluzione fresca. Mescolare bene e conservare con ghiaccio fino all'iniezione. Non superare i 30 minuti per evitare l'aggregazione nella soluzione.

3. Anestesia

1. Preparare la soluzione madre degli anestetici, etil-m-amminobenzoato metanosolfonato allo 0,1% (MESAB), in normale acqua di pesce dal sistema circolante. Preparare la soluzione di anestesia a una concentrazione finale dello 0,0025% (v/v).
2. Estrarre il numero desiderato di pesci dalle vasche in un contenitore per il trasporto con 5 L di acqua di sistema.
3. Riempire a metà una capsula di Petri di plastica (90 mm) con 40 ml di anestetico. Utilizzare questa capsula per le iniezioni.
4. Incubare il pesce negli anestetici fino a quando il movimento opercolare non è cessato.

4. Microiniezione cerebroventricolare

1. Preparazione dell'apparecchio per iniezione
   1. Preparare i capillari di iniezione in vetro utilizzando un estrattore ad ago con i seguenti parametri: ciclo di riscaldamento, 537; ciclo di trazione, 250; velocità, 1,5 s; tempo, 80 ms.
   2. Portare l'impostazione della pressione sulla fonte di pressione a 25 psi.
   3. Impostare i parametri del microiniettore su 20 psi per il mantenimento e 10 psi per l'espulsione, 2,5 per il periodo e 100 ms per il gating.
   4. Caricare il capillare di vetro con la soluzione iniettabile. Inserire il capillare di vetro nel supporto per microiniezione. Regolare l'angolo di iniezione a 45°.
2. Mettere un pesce in una nuova capsula di Petri riempita con una soluzione di anestesia.
3. Tenere il pesce con la pinza e orientarlo per l'iniezione.
4. Genera una fessura usando la punta di un ago da 30 G nel cranio sopra il tectum ottico dove le due placche laterali si incontrano. Non inserire la punta nel tessuto cerebrale, ciò causerebbe sanguinamento e danni.
5. Inserire il capillare di vetro nella fessura.
   1. Utilizzare solo la punta dell'ago e non penetrare più di 1 mm attraverso il cranio. Continua a tenere il pesce e inserisci la punta del capillare di vetro attraverso il sito di incisione.
   2. Orientare la punta del capillare di vetro verso il telencefalo con un angolo di 45°. Iniettare 1 μL della soluzione. Il liquido si disperde immediatamente dopo l'iniezione.

5. Recupero

1. Rimetti il pesce in un contenitore per il trasporto fino a quando non si riprende. Collegare il contenitore all'acqua dei pesci che circola regolarmente per garantire una qualità ottimale dell'acqua.
   nota: Il recupero dovrebbe normalmente richiedere 1 minuto. Se ci vuole più tempo, il pesce deve essere tenuto in anestesia per un tempo più breve (lo sperimentatore deve ottimizzare questo).

Risultati

Tabella 1: Sequenze peptidiche Aβ42 e TR-Aβ42.

...

peptide	Sequenza peptidica	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aminoacidi protetti da Fmoc	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania)		Amminoacidi a base di Fmoc per la sintesi di peptidi in fase solida (SPPS)
N,N,N',N'-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronio esafluorofosfato (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania)	RL-1030	attivatore
Ossima	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania)	RL-1180	Supressore di racemizzazione
N,N-diisopropiletilamina	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania)	SOL-003	base
Dimetilformammide	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania)	SOL-004	solvente
N-metilmorfolina	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germania	Codice A12158	base
1-idrossibenzotriazolo idrato (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, Stati Uniti)	157260 ALDRICH	attivatore
Piperidina	MERCK KGaA (Darmstadt, Germania)	822299	Reagente di deprotezione Fmoc
Diclorometano (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germania)	Codice 106050	solvente
Acido formico (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germania)	100264	Componente tampone per HPLC
Acido trifluoroacetico (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germania)	Codice 808260	Reagente Clevage Miscela
Triisopropilsilano (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germania)	233781 ALDRICH	Reagente Clevage Miscela
Acetonitrile (per UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	solvente
Acetonitrile (per HPLC)	VWR International Ltd, Inghilterra	Codice 83639,32	solvente
Dietiletere	VWR International Ltd, Inghilterra	Codice 23811.326	Solvente per la precipitazione di peptidi
Ditiotritolo (DTT)	VWR International Ltd, Inghilterra	0281-25G	Reagente Clevage Miscela
TentaGel S RAM Fmoc resina ammidica per piste di pattinaggio	Rapp Polymere GmbH (Tubinga, Germania)	S30023	Fase solida per SPPS
Siringhe per sintesi peptidica da 5 ml con filtri inclusi	Intavis AG (Colonia, Germania)	34.274	Provetta di reazione per SPPS e per scissione dalla fase solida
Filtro in politetrafluoroetilene (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)	11806-50-N	Filtrazione di peptidi precipitati
Filtro per siringa in polivinilidenefluoruro (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Pre-filtrazione per HPLC
Sintetizzatore di peptidi	Intavis, Colonia, Germania	ResPep SL	Sintetizzatore di peptidi in fase solida automatizzato
Alleanza dell'acqua HPLC	Waters, Milford Massachusetts, Stati Uniti	Acque 2998, Acque e2695	Cromatografia liquida ad alta pressione semi-preparativa in fase inversa (HPLC)
PolymerX, dimensione del cordone 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Germania	00G-4328-N0	Colonna HPLC in polistirene poroso divinilbenzene
Milli-Q Advantage A10, con filtro Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, Stati Uniti	LCPAK0001	Sistema di depurazione dell'acqua
Unità di filtrazione	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)	Codice: 16307	Unità di filtrazione per la precipitazione dei peptidi
UPLC Aquity con rivelatore UV	Waters, Milford Massachusetts, Stati Uniti	M09UPA 664M	Ultra HPLC analitica in fase inversa per LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, dimensione del cordone 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford Massachusetts, Stati Uniti	186002350	Colonna analitica C18
Rivelatore ACQUITY TQ	Waters, Milford Massachusetts, Stati Uniti	Visualizzazione del materiale QBB908	Spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS)
CRISTO ALFA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germania	16706, 101542	Liofilizzatore con pompa a vuoto
Lettore di targhe Paradigm	Beckman Coulter
MESAB (etil-m-amminobenzoato metanosolfonato)	Sigma-Aldrich	Codice: A5040
Piastre di Petri	Sarstedt	821.472
Soluzione salina tamponata con fosfati	Tecnologie per la vita, GIBCO	Codice 10010-056
ago	Becton-Dickinson	305178
Microscopio da dissezione	Olimpo, Leica, Zeiss	Varia a seconda del produttore
Dumont Pinzetta	Strumenti di precisione mondiali	501985
Pinze da dissezione Gillies	Strumenti di precisione mondiali	501265
Capillari di iniezione in vetro	Strumenti di precisione mondiali	TWF10
PicoUgello	Strumenti di precisione mondiali	Codice: 5430-12
PicoPump pneumatica	Strumenti di precisione mondiali	SYS-PV820
Illuminatore anulare; Guida luminosa anulare	Parco scientifico	ILL-RLG