Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparare Strumenti Chirurgici e Soluzioni per la Chirurgia
- Autoclava tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
- Preparare etanolo al 70% diluendo etanolo assoluto a 200 gradi con acqua distillata deionizzata sterile di grado molecolare.
- Collegare l'ago da 29 G alla siringa Hamilton. Pulire l'interno della siringa e dell'ago di Hamilton aspirando ed espellendo ripetutamente acqua nanopura per 1 minuto. Ripetere questa procedura con etanolo al 70%.
- Rimuovere lo stantuffo e l'ago dalla siringa di Hamilton. Asciugare le parti all'aria in una cappa a flusso laminare O/N.
- Irradiare l'ago e la siringa con luce ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.
- Preparare una soluzione salina sciogliendo il cloruro di sodio (NaCl) in acqua di grado molecolare fino a una concentrazione finale peso/volume dello 0,9%. Sterilizzare la soluzione filtrandola attraverso un filtro per pori da 0,2 μm.
2. Preparare l'amiloide-beta oligomerica (Aβ1-42)
- Monomerizzare e risospendere l'Aβ1-42 umano ricombinante in dimetilsolfossido (DMSO) a 5 mM esattamente come descritto nella pubblicazione di Fa' e altri.
- Diluire 5 mM di Aβ1-42 con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile (1x) a 100 μM il giorno prima dell'intervento.
- Mescolare bene la soluzione mediante triturazione.
- Incubare la soluzione di Aβ1-42 per 12 ore a 4°C.
nota: Le soluzioni di controllo, come la diluizione del DMSO in PBS o il peptide Aβ1-42 criptato/inverso, devono essere preparate allo stesso modo dell'Aβ1-42.
3. Determina le coordinate dell'iniezione
- Usa l'atlante cerebrale del topo adulto per determinare le esatte coordinate antero-posteriore (AP), mediale-laterale (ML) e dorso-ventrale (DV) per la regione cerebrale di interesse.
nota: Per illustrare la tecnica abbiamo scelto il giro dentato dell'ippocampo come bersaglio con le seguenti coordinate dal bregma: AP, -2.00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. Il segno negativo che precede il valore AP indica che si trova 2,00 mm dietro la bregma. Il segno ± che precede il valore ML indica la direzione sinistra e destra dal centro. Infine, il segno negativo che precede il DV indica che si sta muovendo ventralmente dalla superficie del cervello.
4. Configurazione del telaio stereotassico
- Indossare una mascherina chirurgica, un camice da laboratorio pulito e guanti chirurgici sterili.
- Pulire lo strumento stereotassico e l'adattatore per mouse con etanolo al 70%.
- Stendere un telo chirurgico sterile sul bancone.
- Posizionare lo strumento stereotassico con un adattatore per mouse sopra il telo chirurgico sterile.
- Pulisci il tappetino riscaldante del mouse con etanolo al 70%. Posizionare il termoforo sopra il letto a telaio stereotassico. Utilizzare un nastro adesivo da laboratorio per uso generico per fissare il termoforo sopra il piano dell'adattatore del mouse.
- Collegare il termoforo alla pompa di ricircolo dell'acqua calda secondo le indicazioni del produttore.
- Accendere la pompa di ricircolo dell'acqua calda, impostare la temperatura a 37 °C e attendere che raggiunga tale temperatura.
- Fissare la siringa Hamilton da 50 μl con un ago da 29 G sul telaio stereotassico avvitandola sullo stelo di iniezione verticale motorizzato secondo le indicazioni del produttore.
- Accendere lo sterilizzatore a microsfere e attendere che raggiunga la temperatura preimpostata dal produttore.
nota: Viene utilizzato per sterilizzare strumenti in acciaio inossidabile tra gli animali. Gli strumenti impiegano 20 secondi di contatto con le perle per la sterilizzazione.
- Accendi la piastra riscaldante, impostala a 42 °C e posiziona sopra una gabbia vuota e pulita.
- Mentre la siringa di Hamilton è fissata sul telaio stereotassico, utilizzare l'iniettore stereotassico motorizzato per aspirare la soluzione di Aβ1-42.
nota: Aspirare più di 4 μl di soluzione nella siringa e quindi utilizzare l'iniettore stereotassico per impostare il volume di iniezione. Azionare l'iniettore secondo le istruzioni del produttore.
5. Preparazione degli animali
- Determinare il peso del mouse utilizzando la bilancia.
- Anestetizzare il topo con un cocktail di ketamina/xilazina a 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina iniettandosi per via intraperitoneale (IP). Monitorare la profondità dell'anestesia mediante la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
- Dopo che il topo è stato sedato, prendi il tagliacapelli e rasagli la testa per esporre la pelle sopra il cranio.
- Posiziona il mouse sopra il termoforo sopra il letto stereotassico.
- Usa la spatola per aprire la bocca e posiziona i denti incisivi all'interno della protezione dei denti. Fissare il nasello sulla faccia del mouse. Fissalo delicatamente e non troppo stretto.
- Posizionare le barre trasversali auricolari bilaterali nel meato uditivo per fissare la testa. Sposta ogni traversa fino a quando non colpisce il teschio, quindi gira la vite per bloccarla.
- Per assicurarsi che la testa sia fissata, utilizzare il dito indice per spingere delicatamente verso il basso la testa. Se la testa è fissata correttamente, non cede né si muove quando viene premuta.
- Applicare una goccia di crema per gli occhi o un collirio sugli occhi per mantenerli umidi. Assicurati che gli occhi siano umidi durante la procedura chirurgica.
- Per disinfettare il sito chirurgico utilizzare tamponi di cotone sterili per applicare la soluzione di betadina sulla pelle sopra il cranio, seguita da etanolo al 70%. Eseguire la pulizia alternata con betadina ed etanolo al 70% altre 2 volte.
6. Chirurgia e infusione
- Usa un bisturi per praticare un'incisione di 2-3 mm nella linea mediana del cuoio capelluto, quindi usa le forbici sottili dritte per estendere la linea di incisione a 1,0-1,5 cm per esporre la sutura sagittale, il bregma e la lambda del cranio, punti di riferimento su cui si basano le coordinate stereotassiche. Utilizzare micro morsetti per tenere la pelle separata.
nota: Le posizioni di bregma e lambda sono spiegate nell'atlante del cervello del topo "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates".
- Prendi un batuffolo di cotone, immergilo in soluzione salina sterile e usalo per pulire il cranio. Quindi, usa un batuffolo di cotone pulito e asciutto per asciugare il cranio.
- Usa una penna sterile a punta fine per segnare un punto sul bregma. Utilizzare il micromanipolatore stereotassico per posizionare la siringa di Hamilton in modo che la punta dell'ago tocchi appena il punto sul bregma.
- Registra le coordinate DV.
- Per verificare se l'asse AP del cranio è in piano, spostare la siringa di Hamilton posteriormente in modo che la punta dell'ago tocchi il punto lambda.
- Registrare la posizione DV. Assicurati che le coordinate DV per bregma e lambda siano entro 0,5 mm.
nota: L'obiettivo è ridurre al minimo la differenza DV tra bregma e lambda.
- Utilizzare il micromanipolatore per riportare la punta dell'ago della siringa Hamilton al punto bregma.
- Registra la posizione AP di partenza.
- Calcolare la posizione PA finale sottraendo 2,00 mm dalla coordinata PA iniziale.
- Utilizzare il micromanipolatore per riposizionare l'ago della siringa di Hamilton sulla coordinata AP finale.
- Registra la coordinata ML corrente.
- Calcola le coordinate ML finali sinistra e destra aggiungendo o sottraendo 1,3 mm dalla coordinata ML iniziale.
- Utilizzare il micromanipolatore per spostare l'ago della siringa di Hamilton sulla coordinata ML finale.
- Toccare la punta dell'ago sulla superficie del cranio su entrambe le coordinate ML finali e registrare le coordinate DV e assicurarsi che i valori siano entro 0,5 mm.
NOTA: l'obiettivo è ridurre al minimo la differenza DV tra le due coordinate ML finali.
- Mentre sei su una coordinata finale, tira l'ago verso l'alto di 0,5-1 cm sopra il cranio. Prendi una penna sterile a punta fine per segnare un punto sulla superficie del cranio. Ripeti questo passaggio per il lato controlaterale del cranio.
- Spostare la siringa di Hamilton in modo che non sia d'intralcio.
- Fissare la testa del trapano da 0,8 mm al trapano. Prendi il trapano con entrambe le mani, posiziona i gomiti sulla superficie del tavolo per stabilità e posiziona la testa del trapano leggermente sopra il punto del pennarello sulla coordinata ML sinistra o destra. Attiva il trapano, abbassa la punta del trapano sulla superficie del cranio per introdurre un foro nel cranio. Ripetere questo passaggio per il lato controlaterale.
nota: Potrebbe verificarsi un po' di sanguinamento dai fori appena introdotti. Se c'è sanguinamento, usa un batuffolo di cotone pulito e asciutto per tamponare il sangue.
- Riportare la siringa di Hamilton in posizione su uno dei fori ML appena introdotti. Abbassa l'ago di Hamilton appena oltre il cranio. A questo punto fate attenzione a non forare il cervello. Per assicurarti che l'ago abbia superato il cranio, prendi il dito indice e spingi delicatamente l'ago contro il cranio per assicurarti che l'ago non esca dal foro.
- Registra la coordinata DV iniziale.
- Calcola la coordinata DV finale sottraendo 2,2 mm dalla coordinata DV iniziale.
- Abbassa l'ago fino alla coordinata DV finale.
- Attivare la pompa iniettore stereotassica per pompare 4 μl di Aβ1-42 nel giro dentato a una velocità di 0,5 μl/min.
- Al termine dell'infusione, lasciare che l'ago rimanga in posizione per un ulteriore 1 minuto per ridurre al minimo il riflusso della soluzione fuori dal sito di iniezione.
- Sposta l'ago sull'altro lato del cervello e ripeti i passaggi 6.13-6.18.
7. Rimozione degli animali e cura postoperatoria
- Svitare le barre auricolari e la protezione per viso/naso. Rimuovere il mouse dall'apparecchio.
- Usa una pinza standard per studenti per avvicinare il cuoio capelluto e poi sigillare la ferita con una sutura.
