Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Abstract

Source: Er, S. et al., Studio dell'accumulo di α-sinucleina indotto da fibrille preformate nei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario.J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra il processo di quantificazione dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni dopaminergici embrionali di topo pre-trattati con fibrille preformate di alfa-sinucleina. Descrive i passaggi per fissare, colorare e quantificare i neuroni dopaminergici contenenti aggregati di alfa-sinucleina utilizzando l'immunofluorescenza.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione

1. Preparare il terreno neuronale della dopamina (DPM) con 0,46% D-glucosio, 1% L-glutammina, 1% N2, 0,2% primocina, completato con DMEM/F12. Filtrare il DPM dopo aver mescolato gli ingredienti. Conservare il DPM a 4 °C e scaldare ogni aliquota una sola volta.
   nota: Il DPM non deve contenere il fattore neurotrofico derivato dalla glia (GDNF), poiché riduce l'accumulo di α-sinucleina nei neuroni dopaminergici.
2. Preparare pipette di vetro siliconato che siano estremamente idrofobiche, riducendo così al minimo l'attaccamento alla superficie e la perdita di cellule durante la manipolazione iniziale dei neuroni embrionali.
   1. Aggiungere 10 ml di fluido siliconizzante a 1 litro di acqua distillata e mescolare mescolando in un recipiente da 2 litri. Lasciare le pipette di vetro immerse nella soluzione siliconante per 15 minuti.
   2. Sciacquare le pipette 3-5 volte con acqua distillata. Asciugare le pipette per una notte a temperatura ambiente (RT) o per 1-2 ore a 100-120 °C in uno spazio sterile riscaldato per accelerare l'essiccazione.
   3. Sterilizzare le pipette in autoclave standard in una sacca sigillata per autoclave.
3. Preparare piastre a 96 pozzetti rivestite di poli-L-ornitina (PO) con fondo trasparente aggiungendo 60 μL di soluzione di PO nei pozzetti centrali della piastra a 96 pozzetti da utilizzare per la semina dei neuroni, lasciando almeno una fila/colonna di pozzetti ai bordi della piastra per evitare effetti sui bordi. Conservare la lastra rivestita per una notte a 4 °C o 4 ore a RT.
4. Prima di galvanizzare le cellule, aspirare completamente il PO e lavare le cellule tre volte con 100 μl di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Aspirare 1x PBS dai pozzetti e tenere aperto il coperchio della piastra per una completa asciugatura.
   nota: È possibile raccogliere gli ordini di acquisto usati e filtrarli per il riutilizzo. Questa operazione può essere ripetuta due volte per la stessa soluzione PO.
5. Aggiungere 50 μl di DPM ai pozzetti precedentemente rivestiti. Aspirare il DPM dai pozzetti con un puntale in plastica da 100 μL e contemporaneamente grattare il fondo del pozzetto con movimenti circolari per rimuovere il rivestimento sul perimetro di ciascun pozzetto. Un'isola rivestita in PO rimarrà al centro del pozzo.
6. Sotto una cappa laminare, aggiungere 10 μl di DPM al centro di ciascuna isola rivestita per creare micro isole.
   nota: Una piastra con micro isole ricoperte di DPM può essere tenuta sotto la cappa a flusso laminare per 1-2 ore durante l'isolamento delle cellule.

2. Isolamento del pavimento ventrale del mesencefalo da embrioni di topo E13.5

NOTA: Fare riferimento alla Figura 1 per le fasi di dissezione del pavimento mesencefalico.

1. Prima della dissezione, riempire una capsula di Petri di 10 cm con il tampone di Dulbecco e tenerla in ghiaccio.
2. Eutanasia di una topolina incinta E13.5 secondo le linee guida dell'istituto. Posiziona il mouse sulla schiena e spruzza il corpo anteriore con etanolo al 70%. Sollevare la pelle sopra l'utero con una pinza e praticare un'incisione con le forbici chirurgiche per esporre l'utero.
3. Rimuovere con cautela l'utero e metterlo nella capsula di Petri precedentemente preparata con ghiaccio.
4. Utilizzando le forbici chirurgiche sotto il cappuccio laminare a RT, rimuovere con cura gli embrioni dall'utero. Rimuovere tutti i residui placentari dagli embrioni con una pinza e metterli in una nuova capsula di Petri da 10 cm riempita con tampone di Dulbecco.
5. Usando una pinza o un ago da dissezione, tagliare il quarto posteriore della testa dai punti contrassegnati da frecce nere nella Figura 1A. Togliete il pezzo tagliato dal resto dell'embrione (Figura 1B).
6. Posizionare la parte posteriore del pezzo tagliato verso l'osservatore (Figura 1C) e tagliarlo delicatamente dalla caudale al craniale (Figura 1D). Da 0,5 mm al di sotto dell'apertura del cranio, tagliare una regione di 2 mm²–3 mm², mostrata nella Figura 1E.
7. Raccogliere il pavimento del mesencefalo ventrale (vedere Figura 1F) in una provetta da microcentrifuga vuota da 1,5 mL. Tenere la provetta della microcentrifuga sul ghiaccio fino a quando tutti i pavimenti del mesencefalo non sono raccolti al suo interno.
   nota: In alternativa, i pavimenti del mesencefalo possono essere raccolti con una micropipetta da 1 ml dopo la dissezione di tutti i cervelli embrionali.

3. Stabilire colture primarie di mesencefalo embrionale da embrioni di topo E13.5 in formato piastra a 96 pozzetti

1. Dopo la raccolta dei pavimenti del mesencefalo da tutti gli embrioni nella stessa provetta da 1,5 mL, rimuovere il tampone di Dulbecco residuo e lavare i pezzi di tessuto tre volte con 500 μL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) priva di Ca²⁺, Mg²⁺.
2. Rimuovere l'HBSS e aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,5% nella provetta. Incubare a 37 °C per 30 min.
3. Durante l'incubazione, scaldare 1,5 mL di siero fetale bovino (FBS) a 37 °C, aggiungere 30 μL di DNasi I all'FBS e mescolare. Inoltre, lucidare a fuoco la punta di una pipetta di vetro siliconato. Assicurarsi che il foro non abbia spigoli vivi e abbia all'incirca le stesse dimensioni di un puntale per micropipetta da 1 mL.
   NOTA: In alternativa, per la triturazione è possibile utilizzare un puntale per micropipetta da 1 ml a bassa aderenza. Tuttavia, le pipette in vetro siliconato sembrano dare i migliori risultati.
4. Non appena termina l'incubazione nella fase 3.2, aggiungere 500 μl della miscela FBS/DNasi al tessuto parzialmente digerito. Utilizzare la pipetta di vetro per triturare il tessuto nella miscela FBS/tripsina. Triturare fino a quando i tessuti non si dissociano in minuscole particelle appena visibili. Evitare le bolle durante la triturazione.
5. Lasciare che le particelle rimanenti precipitino sul fondo della provetta per microcentrifuga per gravità. Senza pipettare il precipitato sul fondo, raccogliere il surnatante in una provetta conica vuota in polipropilene da 15 mL.
6. Diluire FBS/DNasi I dal passaggio 3.3 (98:2) con 1.000 μl di HBSS per ottenere FBS/DNasi-I/HBSS (49:1:50). Miscelare pipettando su e giù. Aggiungere 1.000 μl della nuova miscela alle particelle rimanenti nella provetta per microcentrifuga. Triturare nuovamente e ripetere il passaggio 3.5.
7. Ripetere ancora una volta il passaggio precedente per consumare tutti i FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Una volta raccolto tutto il surnatante all'interno della provetta da 15 mL (dai passaggi 3.5, 3.7 e 3.8), utilizzare una centrifuga da tavolo per centrifugare il surnatante (~3 mL) a 100 x g, per 5 min. Rimuovere il surnatante senza toccare le celle pellettate sul fondo.
9. Lavare il pellet di cella aggiungendo 2 ml di DPM alla provetta e centrifugarlo a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio 2 volte per ridurre al minimo i detriti nelle celle pellettate.
   NOTA: utilizzare sempre DPM freschi e riscaldati per i neuroni coltivati. Per le fasi di lavaggio, il DPM non deve essere fresco, ma deve essere preriscaldato a 37 °C.
10. Diluire le cellule con DPM fresco e caldo e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. La quantità di DPM per la diluizione dipende dal numero di embrioni utilizzati per la dissezione dei tessuti. Ad esempio, utilizzare 150 μL di DPM per diluire le cellule ottenute da dieci embrioni.
11. Trasferire 10 μL di cellule in DPM in una provetta per microcentrifuga. Mescolarli con 10 μL di colorante blu di tripano allo 0,4%. Contare le cellule vive (cioè il blu di tripano negativo) utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
    NOTA: Utilizzare 30.000 cellule per la placcatura per pozzetto per ottenere ~1.000 neuroni dopaminergici per pozzetto. Se la densità cellulare è superiore a ~30.000 cellule per 6 μl, diluire ulteriormente le cellule con DPM prima della piastratura in modo che il volume di semina non sia inferiore a 6 μl.
12. Senza toccare il fondo dei pozzetti, rimuovere il DPM dalle micro isole create al passaggio 1.6.
13. Per ottenere una densità cellulare riproducibile in ogni pozzetto, mescolare le cellule mediante pipettaggio delicato prima di essere piastrate nel pozzetto. Con una micropipetta da 1-10 μl, aggiungere 6 μl di cellule al centro del pozzetto nella posizione di ciascuna micro isola precedente.
14. Riempire i pozzetti vuoti ai bordi della piastra con 150 μL di acqua o 1x PBS per ridurre al minimo l'evaporazione dai pozzetti contenenti colture neuronali. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora.
15. Dopo 1 ora, rimuovere la piastra dall'incubatore, aggiungere 100 μl di DPM in ciascun pozzetto con le cellule e riposizionarla nell'incubatore.
16. Due giorni dopo la piastratura (giorno in vitro 2, o DIV2), rimuovere 25 μl e aggiungere 75 μl di DPM fresco per portare il volume finale del terreno a 150 μl ed evitare il più possibile l'evaporazione.
17. Sostituire metà del terreno con DPM fresco (ad esempio, rimuovere 75 μl e aggiungere 75 μl di DPM fresco) a DIV5. Non eseguire alcuna sostituzione del supporto dopo DIV5.

4. Induzione di aggregati di α-sinucleina in neuroni dopaminergici embrionali primari mediante semina con fibrille preformate

Dopo qualsiasi lavoro con fibrille preformate (PFFs) di α-sinucleina, pulire la cappa laminare o qualsiasi apparecchiatura che potrebbe essere entrata in contatto con i PFF con dodecil solfato di sodio (SDS) all'1%, quindi con etanolo al 70%.

1. Prima dell'esperimento, diluire i PFF con 1x PBS a una concentrazione finale di 100 μg/mL. Sonicare i PFF diluiti in provette per microcentrifuga con un sonicatore a bagno ad alta potenza con raffreddamento a bagno d'acqua a 4 °C per 10 cicli, 30 s ON/30 s OFF.
   nota: È fondamentale che le fibrille siano correttamente sonicate per generare frammenti lunghi ~50 nm. La dimensione dei PFF sonicati può essere misurata direttamente dalle immagini al microscopio elettronico a trasmissione dei PFF colorati. La sonicazione può essere ottenuta come descritto sopra in un sonicatore a bagno ad alta potenza. In alternativa, è possibile utilizzare un sonicatore a punta. I PFF sonicati possono essere conservati a -80 °C in piccole aliquote per evitare cicli multipli di congelamento/scongelamento.
2. Su DIV8, aggiungere 3,75 μL di 100 μg/mL di PFF per pozzetto ai 150 μL di terreno nel pozzetto fino a una concentrazione finale di 2,5 μg/mL. Utilizzare la stessa quantità di 1x PBS per il gruppo di controllo.
3. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS e conservare le aliquote a -20 °C. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
   NOTA: Il PFA è tossico; indossare mascherina e guanti durante la preparazione, lavorare sempre sotto una cappa laminare e smaltire tutti i rifiuti solidi e liquidi di PFA secondo le indicazioni dell'istituto.
   1. Scaldare 500 ml di 1x PBS in un recipiente da 1 L. Mettere una barra di agitazione nel recipiente e mettere il recipiente su un agitatore magnetico con funzione di riscaldamento. Regolare la temperatura tra 40 e 60 °C per evitare l'ebollizione mantenendo la soluzione calda.
   2. Misurare 20 g di polvere di PFA sotto il cappuccio in un misurino di plastica monouso. Aggiungere con cautela la polvere di PFA nel recipiente riempito con 1x PBS. Inizia a mescolare la soluzione.
   3. Aggiungere 200 μl di idrossido di sodio 5 M nella soluzione e continuare a mescolare per ~15 minuti fino a quando il PFA non si dissolve completamente.
   4. Dopo che la soluzione appare omogenea, aggiungere 168 μl di acido cloridrico 5 M per bilanciare il pH a ~7. Controllare il pH con strisce indicatrici di pH monouso a colori fissati.
   5. Estrarre il recipiente dal riscaldatore e lasciarlo raffreddare fino a RT. Filtrare la soluzione e aliquotare per la conservazione a -20 °C. Scongelare le aliquote a RT prima dell'uso e non ricongelare successivamente.
4. Su DIV15, rimuovere tutti i terreni dai pozzetti mediante pipettaggio. Aggiungere 50 μl di PFA al 4% in ciascun pozzetto per fissare le cellule e incubare per 20 minuti a RT. Dopo l'incubazione, rimuovere il PFA dai pozzetti e aggiungere 100 μl di 1x PBS a ciascun pozzetto per lavare le cellule. Rimuovi 1 PBS e lava altre 2 volte.
5. Lasciare 100 μl di 1x PBS in ogni pozzetto per evitare che si secchi. Conservare la piastra a 4 °C fino all'esecuzione dell'immunochimica.

5. Colorazione immunofluorescente e imaging automatizzato di neuroni dopaminergici embrionali primari in piastre a 96 pozzetti

1. Rimuovere 1x PBS e permeabilizzare le cellule aggiungendo 100 μl di Triton X-100 allo 0,2% in PBS (PBST) per pozzetto e incubando a RT per 15 minuti.
2. Rimuovere il PBST e aggiungere 50 μl di siero normale di cavallo (NHS) al 5% per pozzetto al PBST. Per bloccare l'attività dell'antigene aspecifico, incubare a RT per 1 ora.
3. Diluire gli anticorpi primari contro la tirosina idrossilasi (TH) e pS129-αsyn (1:2.000) in NHS al 5% in PBST. Aggiungere 50 μl di anticorpi diluiti in ciascun pozzetto e incubare per una notte a 4 °C.
4. Rimuovere gli anticorpi e aggiungere 100 μL di 1x PBS a ciascun pozzetto per lavare le cellule. Rimuovere 1x PBS e ripetere il lavaggio 2x.
5. Per evitare lo sbiancamento delle molecole fluorescenti, iniziare a lavorare in condizioni di luce minima. Diluire gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza (1:400) in PBST. Aggiungere 50 μl di anticorpi diluiti a ciascun pozzetto e incubare a RT per 1 ora.
6. Rimuovere la soluzione di anticorpi e aggiungere 100 μL di 1x PBS a ciascun pozzetto per lavare le cellule. Rimuovere 1x PBS e ripetere il lavaggio 2x.
7. Rimuovere 1x PBS, aggiungere 50 μL di 200 ng/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per pozzetto per colorare i nuclei delle cellule coltivate e incubare a RT per 10 minuti.
8. Lavare le celle 3x con 100 μL di 1x PBS per 5 minuti ciascuna. Conservare 100 μL di 1x PBS in ogni pozzetto dopo l'ultimo lavaggio. Coprire la lastra con un foglio di alluminio e conservarla a 4 °C fino all'imaging.
9. Immagine dei neuroni dopaminergici embrionali primari in una piastra di visualizzazione a 96 pozzetti con uno scanner per piastre ad alto contenuto (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 10x.
10. Regolare le impostazioni in base alle specifiche della piastra a 96 pozzetti, come il tipo di piastra, il produttore, le dimensioni, la distanza tra i pozzetti, nonché il tipo e la quantità di fluido.
11. Selezionare l'area di imaging del pozzetto per coprire tutte le celle in una micro isola. Scegli un esempio per regolare l'autofocus. Basa l'attenzione iniziale su DAPI.
12. Calibrare il tempo di acquisizione per ogni canale fluorescente in base all'intensità della colorazione nei pozzetti di controllo. Regolare i parametri in modo che nei pozzetti di controllo trattati con PFF, si possano distinguere chiaramente le cellule dopaminergiche che ospitano aggregati pS129-αsyn nel soma cellulare, consentendo una quantificazione univoca delle cellule pS129-αsyn positive e pS129-αsyn negative.
    nota: I pozzetti che non contengono PFF non dovrebbero avere alcuna colorazione per pS129-αsyn; pertanto, questi pozzetti possono essere utilizzati come controllo negativo per regolare l'intensità di pS129-αsyn.
13. Imaging di tutti i pozzetti selezionati con un obiettivo 10x contemporaneamente per tutti i canali con colorazione in immunofluorescenza con esattamente gli stessi parametri.
14. Facoltativamente, etichettare le inclusioni di α-sinucleina in un sottogruppo di pozzetti con anticorpi specifici per la α-sinucleina filamentosa per confermare che le variazioni nel numero di inclusioni positive per pS129-αsyn riflettono la riduzione dell'accumulo di proteine piuttosto che l'inibizione della fosforilazione o della defosforilazione di pS129-αsyn.
15. Ripetere il passaggio 5.3, sostituendo l'anticorpo pS129-αsyn con l'anticorpo del filamento di α-sinucleina (1:2.000). Visualizzare la α-sinucleina aggregata colorata come al passaggio 5.13.

Results

Figura 1: Dissezione del pavimento del mesencefalo da embrione di topo E13.5. (A) I punti di taglio nel quarto posteriore della testa sono contrassegnati da frecce nere e linee tratteggiate bianche. (B) Il pezzo è stato rimosso dal resto dell'embrione. Il pezzo rimosso viene cerchiato. (C) Il pezzo è stato ruotato di 90° per essere rivolto posteriorm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4% Trypan Macchia blu	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	15250061
Tubo in polipropilene CELLSTAR da 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania	188261
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
5 M NaOH	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
ViewPlate a 96 pozzetti (nero)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	6005182
99,5% Etanolo (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/A
Fluido siliconizzante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Modellino TS-42799
Provetta per microcentrifuga autoclavata da 1,5 ml	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
Dispositivo di sonicazione Bioruptor	Diagenode, Liegi, Belgio	B01020001
Soluzione salina bilanciata di Hank priva di Ca2+, Mg2+ (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Codice 14175-053
Pacchetti software CellProfiler e CellAnalyst	N/A	N/A	Software open source gratuito
Centrifuga 5702	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	5702000019
Incubatore a CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	N/A
Camera di conteggio	BioRad Inc., Hercules, California, Stati Uniti	1450015
Microscopio ad altissima risoluzione DeltaVision con tavolo d'aria e armadio	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, Stati Uniti	29254706
Deossiribonucleasi-I (Dnasi I)	Roche, Basilea, Svizzera	22098700
D-glucosio	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	21331–020
asino anti-topo AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Codice A21202
asino anti-coniglio AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Codice A31573
asino anti-pecora AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Codice: A11015
Buffer di Dulbecco	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	10500056
Fisherbrand Barra di agitazione in PTFE Plain Economy	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	11507582
Sistema di imaging automatizzato ImageXpress Nano	Molecular Devices, San Jose, California, Stati Uniti	N/A
L-glutammina	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	25030-032
monoclonale di topo anti-tirosina idrossilasi	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Tedesco	Visualizzazione MAB318
Integratore N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	17502-048
Siero di cavallo normale	Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, Stati Uniti	S-2000
paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	158127
polvere di paraformaldeide, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	158127
pH-Fix, strisce indicatrici a colori fissati	Macherey-Nagel, Düren, Germania	Codice 92110
Soluzione salina tampone fospoato (PBS)	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	P4957
Primocina	InvivoGen, San Diego, California, Stati Uniti	formica-pm-1, formica-pm-2
filamento monoclonale anti-alfa-sinucleina di coniglio	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab209538
anti-fosfa-serina129-alfa-sinucleina monoclonale di coniglio	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab51253
RCT Basic, agitatore magnetico IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Germania	Codice 3810000
fattore neurotrofico ricombinante derivato dalla glia umana (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA o Prospec, Ness-Ziona, Israele	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
fibrille preformate (PFF) di topo alfa sinucleina ricombinante	N/A	N/A	Dono del collaboratore, Prof. Kelvin C Luk
Sistema di stereomicroscopio da ricerca	Olympus Corporation, Tokyo, Giappone	SZX10
anti-tirosina idrossilasi policlonale di pecora	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Tedesco	ab1542
Contatore di celle automatizzato TC 20	BioRad Inc., Hercules, California, Stati Uniti	1450102
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Cina	Codice 2199700