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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Modello di cellula
- di ratto F98 GBCulture le cellule F98 GB, ottenute da ATCC, in monostrati utilizzando Eagle Medium modificato di Dulbecco, 10% siero di vitello, 1% penicillina, 1% streptomicina, 1% L-glutammina e 0,1% amfotericina b, e collocarle in un incubatore di CO2 (5% CO2 e 37 °C).
- Inocula le cellule di glioma nel cervello delle femmine di ratti Fischer F344 (peso corporeo 170 g).
- Usa strumenti sterili e indossa sempre guanti sterili.
- Anestetizzare i ratti iniettando una miscela di 74 mg/kg di ketamina e 11 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale (IP) con una siringa da insulina (1 mL, 29 G). Confermare l'anestetizzazione per l'assenza di risposta al riflesso di ritiro dell'arto. Immobilizzare i ratti in un dispositivo stereotassico utilizzando punti di fissazione per il naso e le orecchie. Metti un gel per gli occhi carbomer per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
- Radi il ratto dal livello degli occhi alla parte posteriore del cranio e disinfetta la pelle con povidone-iodio.
- Esponi il cranio attraverso un'incisione mediana del cuoio capelluto di 2 cm, e fai un foro di 1 mm (trapano diamantato) 2 mm posteriormente e 2,5 mm lateralmente alla bregma nell'emisfero frontale destro.
- Inserisci un ago per insulina a guida stereotassica (29 G) e inietta 5 μL di sospensione cellulare (20.000 cellule F98 GB) a 3 mm di profondità utilizzando un controller per micro-pompa a siringa (impostazioni: iniezione (I50), velocità 1 nL/s (001 SDN)).
- Ritira lentamente la siringa e chiudi l'incisione con cera d'osso. Sutura la pelle e disinfettarla con iodio povidone.
- Stabilizza la temperatura corporea dell'animale dopo l'intervento chirurgico utilizzando una lampada rossa. Monitorare il risveglio del ratto fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Tenere tutti gli animali in condizioni ambientali controllate (12 ore di cicli normali luce/buio, 20-24 °C e 40-70% di umidità relativa) con cibo e acqua ad libitum. Assicurati di seguire da vicino gli animali monitorando il loro peso corporeo, il cibo, l'assunzione di acqua, la loro attività e il loro comportamento normale. Utilizzare una dose letale di pentobarbital sodico per l'eutanasia degli animali (160 mg/kg) se si osserva un calo del 20% del peso corporeo o quando il comportamento normale peggiora gravemente (ad esempio, mancanza di toelettatura).