Generazione di un modello di ratto con glioblastoma

Abstract

Fonte: Bolcaen, J., et. al., Irradiazione guidata da PET e risonanza magnetica di un modello di ratto con glioblastoma utilizzando un micro-irradiatore. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra la procedura per stabilire un modello di ratto di glioblastoma iniettando stereotassicamente cellule di glioblastoma che causano tumore cerebrale nella corteccia prefrontale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Modello di cellula

1. di ratto F98 GBCulture le cellule F98 GB, ottenute da ATCC, in monostrati utilizzando Eagle Medium modificato di Dulbecco, 10% siero di vitello, 1% penicillina, 1% streptomicina, 1% L-glutammina e 0,1% amfotericina b, e collocarle in un incubatore di CO₂ (5% CO₂ e 37 °C).
2. Inocula le cellule di glioma nel cervello delle femmine di ratti Fischer F344 (peso corporeo 170 g).
   1. Usa strumenti sterili e indossa sempre guanti sterili.
   2. Anestetizzare i ratti iniettando una miscela di 74 mg/kg di ketamina e 11 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale (IP) con una siringa da insulina (1 mL, 29 G). Confermare l'anestetizzazione per l'assenza di risposta al riflesso di ritiro dell'arto. Immobilizzare i ratti in un dispositivo stereotassico utilizzando punti di fissazione per il naso e le orecchie. Metti un gel per gli occhi carbomer per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
   3. Radi il ratto dal livello degli occhi alla parte posteriore del cranio e disinfetta la pelle con povidone-iodio.
   4. Esponi il cranio attraverso un'incisione mediana del cuoio capelluto di 2 cm, e fai un foro di 1 mm (trapano diamantato) 2 mm posteriormente e 2,5 mm lateralmente alla bregma nell'emisfero frontale destro.
   5. Inserisci un ago per insulina a guida stereotassica (29 G) e inietta 5 μL di sospensione cellulare (20.000 cellule F98 GB) a 3 mm di profondità utilizzando un controller per micro-pompa a siringa (impostazioni: iniezione (I50), velocità 1 nL/s (001 SDN)).
   6. Ritira lentamente la siringa e chiudi l'incisione con cera d'osso. Sutura la pelle e disinfettarla con iodio povidone.
   7. Stabilizza la temperatura corporea dell'animale dopo l'intervento chirurgico utilizzando una lampada rossa. Monitorare il risveglio del ratto fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Tenere tutti gli animali in condizioni ambientali controllate (12 ore di cicli normali luce/buio, 20-24 °C e 40-70% di umidità relativa) con cibo e acqua ad libitum. Assicurati di seguire da vicino gli animali monitorando il loro peso corporeo, il cibo, l'assunzione di acqua, la loro attività e il loro comportamento normale. Utilizzare una dose letale di pentobarbital sodico per l'eutanasia degli animali (160 mg/kg) se si osserva un calo del 20% del peso corporeo o quando il comportamento normale peggiora gravemente (ad esempio, mancanza di toelettatura).

Materiali

GB RAT model			<
ATCC	CRL-2397
Fischer F344/Ico crl Rats	Charles River	N/A	http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat
Sistema di micropompa	World Precision Instruments	UMP3	Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1
Telaio stereotassico	Kopf	902	Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame
Diamond drill	Velleman	VTHD02	https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450
Cera d'ossa	Aesculap	1029754	https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax
Siringa da insulina Microfine	Beckton-Dickinson	320924	1 mL, 29G
InfraPhil IR lamp	Philips	HP3616/01
Ethilon	Ethicon	662G/662H	FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm

td style='height:14.5pt;width:122pt;'>F98 Linea cellulare di glioblastoma