Generazione di un'occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto per indurre l'ischemia cerebrale locale

Abstract

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media di ictus neonatale nei ratti P10. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'istituzione del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto. L'arteria carotide interna (ICA) è esposta e una legatura è fissata per limitare il flusso di sangue. Un occlude viene inserito attraverso l'ICA per raggiungere l'arteria cerebrale media. Il cucciolo viene quindi lasciato riprendersi prima di ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Occlusione dell'arteria cerebrale media

1. Pesa il cucciolo e assicurati che abbia il peso corretto (19-21 g). Anestetizzare il cucciolo con isoflurano al 3% in ossigeno al 100% (O₂) e assicurarsi che non vi sia risposta a un pizzicamento del piede. Mantenere la temperatura della superficie corporea tra 35,5 °C e 37 °C con l'uso di un termoforo sotto la fase chirurgica.
2. Fissare l'animale in posizione supina con del nastro adesivo sulle regioni delle spalle. Utilizzando tamponi di cotone sterili, tamponare l'area cervicale anteriore con una soluzione di iodio povidone seguita da un tampone di etanolo al 70% in acqua bidistillata, alternando ciascuna soluzione per un totale di quattro tamponi.
3. Infiltrare localmente bupivacaina allo 0,25% nel sito di incisione pianificato. Utilizzando uno stereoscopio, praticare un'incisione cervicale anteriore di 5-7 mm per esporre l'arteria carotide comune (CCA). Posizionare 2-4 divaricatori per mantenere la cavità aperta e l'arteria esposta.
4. Localizzare l'arteria carotide interna (ICA), l'arteria occipitale (OA) e l'arteria carotide esterna (ECA). Pulisci le arterie per avere una visione chiara. Fare attenzione a non disturbare il nervo vago.
   NOTA: Per i cuccioli operati con simulazione, l'incisione viene lasciata aperta e le arterie vengono esposte, dopo di che l'incisione viene suturata chiusa. Il tempo totale di anestesia è equivalente a quello dell'intervento di occlusione.
5. Tagliare 1,5 cm di filo di sutura intrecciato in seta 6-0. Slacciare la sutura, estraendo i singoli fili. Assicurati che i singoli fili siano puliti e non sfilacciati.
   NOTA: Se necessario, leviga le estremità sfilacciate immergendo il singolo filamento in acqua sterile e pulendo il filo con le punte delle pinze.
6. Tenendo il filo di sutura con una pinza a 45 gradi, spostare la pinza con un ampio movimento ad arco per passare sotto l'ICA in modo che le punte della pinza emergano tra l'ICA e l'OA.
   NOTA: Se la dissezione è fatta bene, questo passaggio sarà relativamente facile. Se l'ICA e l'OA si toccano, fare attenzione a non rompere le arterie quando si utilizza il forcipe per isolare l'ICA. Se si verifica un'emorragia, applicare pressione sull'arteria con il forcipe fino a quando l'emorragia non si ferma. Assorbire il sangue con un tampone sterile.
7. Afferrare l'estremità del filo di sutura che è trattenuto dalla pinza e tirarlo in modo che l'estremità sia di facile accesso. Rilasciare il filo dalla pinza e far uscire la pinza da sotto l'ICA, invertendo il movimento nel passaggio 1.5 (Figura 1A).
8. Lega una legatura temporanea attorno all'ICA alla base, il più vicino al punto in cui si separa dal CCA.
   NOTA: È importante legare il nodo in modo che l'estremità del filo che verrà tirato per rimuovere il nodo sia abbastanza lunga (maggiore di 1 mm, inferiore a 3 mm) da poter essere afferrata facilmente con una pinza, assicurandosi che ci sia una quantità appropriata di filo di sutura sull'altro lato del nodo per la retrazione.
9. Ritrarre con cautela l'ICA lateralmente e utilizzare una clip per fissare il filo alla pelle in eccesso vicino alla regione ascellare sul lato opposto all'incisione. Assicurarsi che questo filamento retrattile sia sufficientemente teso da interrompere il flusso sanguigno prima di procedere al passaggio successivo per ridurre al minimo il rischio di sanguinamento incontrollato. Osserva che l'arteria è piatta e pallida.
   NOTA: Non ritrarre eccessivamente, poiché può causare una lesione parziale o completa dell'ICA. La retrazione può essere regolata appena prima di eseguire l'arteriotomia tirando il filamento sul lato opposto alla clip.
10. Utilizzare una pinza a 45° per afferrare un altro filo di sutura non intrecciato e avvolgerlo sotto e intorno all'ICA, come al punto 1.5. Posizionare questo filamento lateralmente al filamento di retrazione (Figura 1B).
    NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche prima della ritrattazione. Se non sei sicuro della qualità della retrazione, questo nodo può essere legato in modo molto lasco prima del passaggio successivo.
11. Tagliare un'arteriotomia di 0,2 mm a metà strada tra le legature legate e quelle slegate, avvicinandosi alla legatura legata.
    NOTA: Il sangue rimasto nell'arteria legata può svuotarsi attraverso l'arteriotomia, ma non deve superare i 5 μL. Se il sanguinamento persiste, tirare con cautela il filamento di retrazione per aumentare la retrazione, con cura per evitare di danneggiare l'arteria a causa di un'eccessiva tensione.
12. Utilizzando un righello metrico, misurare la sutura occlusiva e tagliare la sutura con un margine extra di 2-3 mm per rimuovere l'occlusore durante la riperfusione. Tenere l'occlusore con una pinza a 45 gradi e utilizzare una pinza dritta per creare una curva alla lunghezza appropriata per raggiungere l'MCA, segnando un punto di arresto per l'avanzamento.
    NOTA: Una lunghezza di occlusione di 10 mm dall'estremità della punta in silicone alla curva viene utilizzata per i cuccioli di ratto postnatale o P-10 Sprague Dawley o Long Evans in questa gamma di peso.
13. Utilizzando una pinza a 45°, inserire la sutura per occlusione in nylon rivestita di silicone nell'arteriotomia e far avanzare la sutura fino alla curva che segna la distanza predeterminata dall'MCA (Figura 1C). Assicurati che l'avanzamento sia fluido; Arrestare immediatamente l'avanzamento se si avverte resistenza. Durante l'avanzamento, puntare la sutura in una direzione parallela alla CC/ECA, verso la testa.
    NOTA: Se la sutura è avanzata dorsalmente verso la spina dorsale dell'animale, può entrare nell'arteria pterigopalatina (PTA). Se si avverte resistenza dopo 3-5 mm di avanzamento, la sutura ha colpito la giunzione PTA. Estrarre l'occlusore dall'arteria fino a quando la testina in silicone non si trova vicino all'arteriotomia prima di regolare la direzione di avanzamento. Non è necessario rimuovere completamente l'occlusore dall'arteriotomia.
14. Fissare l'occlusore legando una legatura temporanea utilizzando il filamento del passaggio 1.10 (Figura 1D).
15. Rimuovere la clip del divaricatore. Taglia i fili di entrambe le legature temporanee in modo che il filo del nodo che viene tirato per rimuovere il nodo sia facile da afferrare con una pinza dritta e sia più lungo del filo che viene tirato per stringere il nodo.
    NOTA: I fili devono essere abbastanza corti da non aggrovigliarsi nella cavità dopo la chiusura.
16. Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità utilizzando seta intrecciata 6-0 per creare tre o quattro suture interrotte.
17. Togliete il cucciolo dall'anestesia e mettetelo su un termoforo all'aria ambiente. Monitorare il cucciolo fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale e assicurarsi che si sia completamente ripreso prima di riportarlo alla madre. Assicurarsi che il cucciolo mantenga una temperatura della superficie corporea compresa tra 35,5 °C e 37 °C.

Risultati

Figura 1: Immagini chirurgiche in tempo reale della procedura tMCAO. (A) Il primo filamento di sutura viene avvolto attorno all'ICA, come descritto nel passaggio 1.6. (B) La prima legatura temporanea viene legata e l'ICA viene retratta. Il secondo filamento di sutura è avvolto attorno all'ICA, lateralmente al primo filamento di sutura, come descritto nel passaggio 1....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isoflourane	Henry Schein	50033	Anestetico, al 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	Low to medium setting
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Kit di retrazione per piccoli animali	Strumenti di Fine Science	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Pincipe	Strumenti per le scienze fini	112522-00	2x
Dumont #5/45 Pinze<	11251-35	2x
B-2 Micro Morsetto	Strumenti per la Fine Science	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Strumenti per la Fine Science	00072-14
Forbici Micro Vannas	Strumenti per la Fine Science	15000-03	2mm tagliente
Suture per occlusione	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Righello	Strumenti di Fine Science
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
Applicatori con punta in cotone	Henry Schein	100-9249	<
VWR	89097-990

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