Preparazione di plasma ricco di piastrine da sangue periferico umano

Abstract

Questo video mostra la preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP) di alta qualità mediante screening per la conta piastrinica, raccolta e centrifugazione del sangue e isolamento delle piastrine. Questo PRP è utilizzato in applicazioni terapeutiche per la rigenerazione e la guarigione dei tessuti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Raccolta dei campioni

1. Screening dei pazienti utilizzando l'emocromo preliminare per escludere la trombocitopenia e stabilire la conta cellulare al basale. Per fare ciò, utilizzare un emocitometro di livello clinico per la conta cellulare. Assicurarsi che la conta piastrinica sia superiore a 150.000 cellule/μL.

2. Assicurarsi che il paziente sia ben idratato prima della raccolta del campione. Ciò potrebbe essere garantito dall'ispezione visiva della lingua, dal turgore cutaneo e dalla misurazione della pressione sanguigna.

3. Raccogliere 100 mL di sangue venoso periferico dalla vena antecubitale del paziente utilizzando 2 siringhe da 50 mL riempite con 5 mL di anticoagulante acido-citrato-destrosio-adenina (ACDA) in un rapporto di 1:10. Inclinare le siringhe raccolte per una corretta miscelazione dell'anticoagulante per evitare la coagulazione del campione di sangue prima di procedere alla fase successiva.
   NOTA: Un prelievo di sangue lento può comportare una miscelazione inadeguata del sangue raccolto con l'anticoagulante e la coagulazione; quindi, utilizzare una cannula da almeno 18 G per la raccolta del sangue.

4. Trasferire 100 mL di sangue nelle siringhe in 15 mL di provette da centrifugazione a fondo conico con 10 mL in ciascuna provetta.

2. Centrifugazione e isolamento

1. Collocare le provette da centrifugazione in una macchina da centrifugazione da tavolo di livello clinico mantenuta a temperatura ambiente in un ambiente sterile ed eseguire la centrifuga morbida iniziale alla velocità di 100 x g per 15 minuti. Il sangue anticoagulato si separa in tre strati, cioè globuli rossi nella parte inferiore, plasma nella parte superiore e buffy coat nel mezzo.

2. Pipettare lo strato superiore del campione a tre strati in modo sterile utilizzando un ago spinale sterile da 18 G e raccoglierlo in una provetta da centrifugazione a fondo conico separata. Assicurarsi che le provette siano individuali per ogni 10 ml di plasma raccolto.
   NOTA: La decisione di includere il buffy coat dipende dalla natura del plasma ricco di piastrine che stiamo cercando di isolare, che a sua volta dipende dalla natura della sua applicazione clinica. Se il PRP povero di leucociti è il prodotto desiderato, astenersi dall'includere lo strato di buffy coat, mentre se il PRP ricco di leucociti è il prodotto desiderato, allora lo strato superiore di plasma insieme al buffy coat viene pipettato per il secondo ciclo di centrifugazione.

3. Sottoporre il plasma raccolto in provette da centrifugazione da 15 mL con 10 mL di plasma ciascuna a centrifugazione a rotazione dura a 1600 x g per 20 minuti. Le piastrine presenti nel pellet di plasma sul fondo della provetta. Raccogliere il surnatante in una provetta separata.

4. Pipettare il pellet piastrinico in una siringa da 5 ml con l'aiuto di un ago spinale sterile da 18 G. Raccogliere tutte le provette con i pellet in un'unica siringa da 5 ml per l'applicazione.

5. Ricostituire il pellet raccolto con volumi sufficienti per l'uso clinico con il plasma surnatante nella provetta da centrifugazione dopo il secondo ciclo di centrifugazione.

3. Convalida

1. Sottoporre il PRP finale preparato alla conta cellulare utilizzando un ematocitometro di grado clinico per calcolare la conta piastrinica e calcolare la conta piastrinica assoluta nel PRP, il gradiente di concentrazione piastrinica raggiunto rispetto al basale e l'efficacia del recupero piastrinico del protocollo utilizzando la seguente formula.
   Conta piastrinica assoluta = conta piastrinica del PRP in μL x 1000 x volume di PRP in mL
   Gradiente di concentrazione piastrinica =
   Efficienza di recupero piastrinico =
   Ad esempio, per la preparazione del PRP vengono utilizzati 100 ml di sangue con una conta piastrinica basale di 200.000 / μL, e si ottengono 5 mL di PRP con una conta piastrinica finale di 3.000.000/μL. I parametri sopra indicati sono calcolati come segue:
   Conta piastrinica assoluta = 3.000.000 x 1000 x 5 = 15 miliardi di piastrine
   Gradiente di concentrazione piastrinica = 3.000.000 / 200.000 = 15
   Efficienza di recupero piastrinico = 3.000.000 x 1000 x 5 / 200.000 x 1000 x 100 = 75%

2. Garantire l'efficienza di recupero del protocollo attraverso cicli ripetuti. Un protocollo efficace utilizzato fornisce un gradiente di concentrazione superiore a 5 volte il basale con un'efficienza di recupero del >80%. In base all'utilizzo desiderato del volume di PRP, la conta piastrinica che deve essere erogata può essere titolata di conseguenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione anticoagulante citrato destrosio IP	Fresenius Kabi, India	ACDAIP/L/A/19/00
BD Ago di Quincke	Becton Dickinson, Spagna	405125	18G
DISPOVAN 50ml siringa	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, India
DISPOVAN 5ml siringa	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, India
Spinwin Tube Conical Bottom	Tarsons, India	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., Stati Uniti d'America	XN 350
Macchina per centrifugazione clinica da tavolo	REMI, India	R-8C	4x4 rotore oscillante a pozzetto

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